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【关键词】 乳腺癌;Foxm1;Gli2;Hh信号通路
中图分类号：R737.9 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.01.020
Expression of Foxm1 and Gli2 and its’ clinical significance in breast cancer
WANG Shuli，ZHANG Jingjing，HOU Yuhua
【Abstract】 Objective To analyze the expression of Foxm1 and Gli2 in breast cancer tissues，and to discuss the effect of the two in the occurrence，progression，invasion and metastasis of breast cancer，so as to provide reference indexes for the diagnosis and metastasis evaluation of breast cancer.
Methods 106 specimens of breast cancer were collected，including 68 cases of invasive breast cancer and 38 cases of breast fibroadenoma. A total of 40 cases of normal breast tissue beside the cancer were taken as controls. Immunohistochemical method was used to detect the expression of Foxm1 and Gli2 in these specimens. Relationship between the expression of Foxm1 and Gli2 in breast cancer tissues as well as relationship between them and the clinical characteristics of breast cancer were analyzed.
Results The expression levels of Foxm1 protein and Gli2 protein in breast cancer tissues were significantly higher than those in breast fibroadenoma tissues and normal breast tissues （P<0.05）.The positive rates of Foxm1 and Gli2 in breast cancer tissues with lymph node metastasis were higher than those without lymph node metastasis （P<0.05）.Spearman correlation analysis showed that Foxm1 was positively correlated with Gli2 （r=0517，P<0.001）.
Conclusion Foxm1 and Gli2 are highly expressed in breast cancer tissues，they have certain correlation，and may involve in the process of occurrence，invasion and metastasis of breast cancer.Therefore，the detection of expression levels of them may be of guiding significance for the diagnosis of breast cancer and the assessment of whether there is a metastasis.
【Key words】 breast cancer;Foxm1;Gli2;Hh signaling pathway
乳腺癌是女性常見的恶性肿瘤，它对女性的健康造成了极大威胁，癌细胞转移是引起患者死亡的重要原因。近年来，虽然肿瘤治疗手段已取得了极大进展，但乳腺癌的常规治疗效果并不理想。近期的研究证实，分子靶向药物治疗可有效延长乳腺癌患者的生存期，改善其生活质量[1]。故了解乳腺癌发生、进展的信号通路及关键分子，找到乳腺癌的治疗靶点是广大学者关注的热点。Foxm1是一种特异性细胞增殖转录因子，它对细胞周期变化具有调节作用，参与了乳腺癌的发生、进展过程[2]。有研究发现，Foxm1的转录受Hedgehog（Hh）信号通路的下游转录因子Gli2调控，Gli2基因是Hh信号通路的直接转录靶点。肿瘤的增殖是通过解除细胞周期的控制，活化Hh信号通路来实现[3]。本研究采用免疫组化法检测乳腺癌、良性乳腺肿瘤及正常乳腺组织中的Foxm1、Gli2蛋白表达，以探讨两者在乳腺癌中的作用机制及临床意义。
1.1 实验材料
收集2015年8月至2017年2月在河南郑州市中心医院妇科手术切除并进行石蜡包埋的乳腺肿瘤标本106例，其中浸润性乳腺癌68例，乳腺纤维腺瘤38例。另以癌旁正常乳腺组织作为对照，共40例。上述标本的患者均为初次发病，年龄30～72岁，平均年龄为（53.6±6.1）岁，术前未接受其他方法治疗。所有病理诊断均由本院经验丰富的病理医生确认。 1.2 实验试剂
兔抗人Foxm1多克隆抗体（美国ABGENT公司），Gli2多克隆抗体（英国Abcam公司），抗体工作液和DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术公司）。
1.3 免疫组化法检测
将上述标本石蜡切片脱蜡、梯度酒精脱水，室温下置于3%过氧化氢溶液终孵育5～10 min，PBS冲洗3次，每次5 min。血清封闭，滴加抗Foxm1、Gli2一抗（Gli2按1∶200，Foxm1按1∶300稀释），4℃孵育过夜。PBS冲洗3次，每次5 min，滴加对应二抗工作液，37℃孵育30 min。PBS冲洗3次，每次5 min，滴加生物素标记的二抗，滴加少量DAB显色液反应3 min，复染、脱水、镜检。以PBS液代替一抗作为阴性对照。
1.4 结果判定
Foxm1蛋白定位于细胞浆和细胞核，阳性染色时胞浆和胞核呈淡黄、棕黄色甚至棕褐色;Gli2蛋白定位于细胞浆，阳性染色时胞浆呈淡黄、棕黄色甚至棕褐色。根据镜下切片染色强度及阳性细胞的占比评分。染色强度：无染色计0分;淡黄色计1分;深黄色计2分;棕褐色计3分。阳性细胞占比<5%计0分;阳性细胞占比为5%～25%计1分;阳性细胞占比为26%～50%计2分;阳性细胞占比为51%～75%计3分;阳性细胞占比为76%～100%计4分。免疫组化评分=染色强度评分×阳性细胞占比评分[4]。免疫组化评分总分为0～12分，分为：阴性（≤1分）、弱阳性（≤3分）、阳性（≤6分）、强阳性（>6分）。免疫组化评分2分及以上者表示阳性表达。
1.5 统计学方法
选用SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析，计量资料用（±s）表示，多组间比较用协方差分析，两两比较用SNK法检验，计数资料用百分比（%）表示，组间比较用χ2检验，Foxm1与Gli2间的关系用Spearman等级相关性检验，检验水准：α=0.05，双侧检验。
2.1 乳腺癌组织、乳腺纤维腺瘤组织及正常乳腺组织中的Foxm1、Gli2蛋白表达情况
Foxm1蛋白在细胞浆和细胞核中均有表达，正常乳腺组织少量表达或无表达，乳腺纤维腺瘤弱陽性表达，乳腺癌组织强阳性表达（见图1）。Gli2蛋白表达于胞浆，正常乳腺组织极少表达或无表达，乳腺纤维腺瘤弱阳性表达，乳腺癌组织表达明显增强（见图2）。乳腺癌组织Foxm1蛋白、Gli2蛋白表达评分高于乳腺纤维腺瘤组织和正常乳腺组织（P<0.05）。见表1。
2.2 Foxm1和Gli2的表达与乳腺癌临床病理特征的关系
Foxm1和Gli2的表达与乳腺癌患者年龄、肿瘤直径、组织学分级、临床分期差异无统计学意义（P>0.05），有淋巴结转移者的乳腺癌组织的Foxm1和Gli2的阳性表达率高于无淋巴结转移者，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
2.3 Foxm1与Gli2表达的关系
Spearman等级相关检验结果显示，Foxm1与Gli2呈正相关（r=0.517，P<0.001）。
Foxm1为叉头框蛋白家族，是一类具有严格细胞核定位，DNA结合区具有翼状螺旋结构的转录因子。它属于增殖特异性蛋白，可通过调控细胞周期来促进细胞增生和有丝分裂，在静止或未分化细胞中低表达或无表达，而在增殖细胞中高表达[5]。Foxm1的活化过程中是多因子、多细胞信号通路共同参与作用的结果，信号通路包括Hh信号通路和Ras-MAPK信号通路[6]。Hh信号通路是由Hh配体、跨膜蛋白质受体patched和Smoothened组成的受体复合物、下游转录因子Gli蛋白（Gli1、Gli2、Gli3）等组成，它的激活与多种肿瘤的发生、进展及侵袭和转移均密切相关[7]。有研究报道，敲除Gli2基因可使其相关蛋白表达水平降低，且会极大降低Foxm1的表达水平，提示Gli2与Foxm1在肿瘤的发生和进展中可能有一定的关系[8]。Gli2作为Hh信号通路的转录因子之一，对下游多种靶基因的表达具有调控作用，如与细胞增殖、分化有关的基因（cyclin D1）、抗凋亡基因Bcl2等[9]。大量研究报道，在多种恶性肿瘤（如基底细胞癌、前列腺癌、肺癌等）中均有Gli2的异常高表达，其过表达与低预后有关[10]。而且Foxm1作为Hh信号通路的下游靶基因，Hh信号通路活化后可上调Foxm1基因的表达[11]。 盖领等人[12]研究显示，Foxm1在乳腺浸润癌中的表达显著升高，其表达水平与肿瘤直径、临床分期、淋巴结转移密切相关。李周芳等[13]研究指出，Foxm1在乳腺癌细胞增殖过程中起重要的调控作用。本研究结果显示，正常乳腺组织中Foxm1呈低表达或不表达，乳腺纤维腺瘤组织表达量有所增加，而乳腺癌组织中表达量显著增高，染色强度明显强于正常乳腺组织和乳腺纤维腺瘤;而且在乳腺癌组织中，Foxm1虽与患者年龄、肿瘤直径、组织分级及临床分期无明显相关性，但在有淋巴结转移的乳腺癌组织中阳性率明显高于无淋巴结转移者，说明Foxm1蛋白表达上调与乳腺癌淋巴结转移密切相关。本研究同时也发现，Gli2蛋白在乳腺癌组织中的表达水平也明显高于正常乳腺组织和乳腺纤维腺瘤组织，且与淋巴结转移的关系与Foxm1相似。Spearman秩和相关检验结果显示，Foxm1与Gli2呈正相关，这一结果佐证了Gli2作为Hh信号通路的转录因子，其对作为Hh信号通路下游靶基因的Foxm1的表达具有调控作用。 综上所述，Foxm1、Gli2在乳腺癌组织中均高表达，两者存在一定的相关性，可能参与了乳腺癌的发生和侵袭转移过程，因此对两者表达水平进行检测，可能对乳腺癌的诊断及是否转移的评估具有指导意义。
[1] 甘绍举，王 青，朱丽敏，等.靶向治疗药物在乳腺癌中的研究进展[J].基础医学与临床，2015，35（1）：134-137.
[2] 周 磊，张萍海，徐 欣，等.下调叉头转录因子M1基因表达对非小细胞肺癌细胞生长与侵袭能力的影响[J].中华医学杂志，2009，89（34）：2424-2426.
[3] 石 超.Gli2通过FoxM1调控KIF20A影响肝癌细胞增殖的分子机制[D].南昌：南昌大学，2015.
[4] 杨建敏，胡静文.Foxm1 蛋白在人宫颈癌组织中的表达及与病理类型、分级、分期之间的关系[J].广东医学，2015，37（14）：2150-2152.
[5] 孔飞飞，袁海花，王炯轶，等.Foxm1对非小细胞肺癌中 MMP-2、MMP-9和迁移侵袭的影响[J].现代肿瘤医学，2014，26（8）：1775-1778.
[6] 冯亚光，魏正强，曾绍兵，等.Gli1和Foxm1在胃癌中的表达及其临床意义[J].中國肿瘤临床，2012，39（7）：377-381.
[7] 陈 丹，陈 红，董良波，等.Gli1与FoxM1在子宫颈癌组织和细胞中的表达及意义[J].武汉大学学报（医学版），2016，37（3）：430-435.
[8] Chen H，Zou Y，Yang H，et al.Downregulation of FoxM1 inhibits proliferation，invasion and angiogenesis of HeLa cells in vitro and in vivo[J].Int J Onc，2014，45（6）：2355-2364.
[9] 林中啸，蔡 铭，虞晓明，等.Gli2在髓母细胞瘤中的表达及其靶向抑制剂的作用与意义[J].医学研究杂志，2015，44（4）：66-70.
[10] Buczkowicz P，Ma J，Hawkins C.GLI2 is a potential therapeutic target in pediatric medulloblastoma[J].J Neur Exp，2011，70（6）：430-437.
[11] 张大伟，曹良启，卢海武，等.Hedgehog 信号通路转录因子Gli2在肝癌组织中的表达及意义[J].中华普通外科学文献（电子版），2013，7（1）：12-16.
[12] 盖 领，茅国新，赵铃铃，等.FOXM1在人乳腺癌组织和MCF-7细胞中的表达及临床意义[J].基础医学与临床，2015，35（8）：1100-1105.
[13] 李周芳，高 伟，李惠翔.FoxM1在乳腺浸润性导管癌组织中的表达[J].肿瘤基础与临床，2013，26（3）：195-197.
中图分类号：R737.9 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.01.020
Expression of Foxm1 and Gli2 and its’ clinical significance in breast cancer
WANG Shuli，ZHANG Jingjing，HOU Yuhua
【Abstract】 Objective To analyze the expression of Foxm1 and Gli2 in breast cancer tissues，and to discuss the effect of the two in the occurrence，progression，invasion and metastasis of breast cancer，so as to provide reference indexes for the diagnosis and metastasis evaluation of breast cancer.
Methods 106 specimens of breast cancer were collected，including 68 cases of invasive breast cancer and 38 cases of breast fibroadenoma. A total of 40 cases of normal breast tissue beside the cancer were taken as controls. Immunohistochemical method was used to detect the expression of Foxm1 and Gli2 in these specimens. Relationship between the expression of Foxm1 and Gli2 in breast cancer tissues as well as relationship between them and the clinical characteristics of breast cancer were analyzed.
Results The expression levels of Foxm1 protein and Gli2 protein in breast cancer tissues were significantly higher than those in breast fibroadenoma tissues and normal breast tissues （P<0.05）.The positive rates of Foxm1 and Gli2 in breast cancer tissues with lymph node metastasis were higher than those without lymph node metastasis （P<0.05）.Spearman correlation analysis showed that Foxm1 was positively correlated with Gli2 （r=0517，P<0.001）.
Conclusion Foxm1 and Gli2 are highly expressed in breast cancer tissues，they have certain correlation，and may involve in the process of occurrence，invasion and metastasis of breast cancer.Therefore，the detection of expression levels of them may be of guiding significance for the diagnosis of breast cancer and the assessment of whether there is a metastasis.
【Key words】 breast cancer;Foxm1;Gli2;Hh signaling pathway
乳腺癌是女性常見的恶性肿瘤，它对女性的健康造成了极大威胁，癌细胞转移是引起患者死亡的重要原因。近年来，虽然肿瘤治疗手段已取得了极大进展，但乳腺癌的常规治疗效果并不理想。近期的研究证实，分子靶向药物治疗可有效延长乳腺癌患者的生存期，改善其生活质量[1]。故了解乳腺癌发生、进展的信号通路及关键分子，找到乳腺癌的治疗靶点是广大学者关注的热点。Foxm1是一种特异性细胞增殖转录因子，它对细胞周期变化具有调节作用，参与了乳腺癌的发生、进展过程[2]。有研究发现，Foxm1的转录受Hedgehog（Hh）信号通路的下游转录因子Gli2调控，Gli2基因是Hh信号通路的直接转录靶点。肿瘤的增殖是通过解除细胞周期的控制，活化Hh信号通路来实现[3]。本研究采用免疫组化法检测乳腺癌、良性乳腺肿瘤及正常乳腺组织中的Foxm1、Gli2蛋白表达，以探讨两者在乳腺癌中的作用机制及临床意义。
1 材料与方法
1.1 实验材料
收集2015年8月至2017年2月在河南郑州市中心医院妇科手术切除并进行石蜡包埋的乳腺肿瘤标本106例，其中浸润性乳腺癌68例，乳腺纤维腺瘤38例。另以癌旁正常乳腺组织作为对照，共40例。上述标本的患者均为初次发病，年龄30～72岁，平均年龄为（53.6±6.1）岁，术前未接受其他方法治疗。所有病理诊断均由本院经验丰富的病理医生确认。 1.2 实验试剂
兔抗人Foxm1多克隆抗体（美国ABGENT公司），Gli2多克隆抗体（英国Abcam公司），抗体工作液和DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术公司）。
1.3 免疫组化法检测
将上述标本石蜡切片脱蜡、梯度酒精脱水，室温下置于3%过氧化氢溶液终孵育5～10 min，PBS冲洗3次，每次5 min。血清封闭，滴加抗Foxm1、Gli2一抗（Gli2按1∶200，Foxm1按1∶300稀释），4℃孵育过夜。PBS冲洗3次，每次5 min，滴加对应二抗工作液，37℃孵育30 min。PBS冲洗3次，每次5 min，滴加生物素标记的二抗，滴加少量DAB显色液反应3 min，复染、脱水、镜检。以PBS液代替一抗作为阴性对照。
1.4 结果判定
Foxm1蛋白定位于细胞浆和细胞核，阳性染色时胞浆和胞核呈淡黄、棕黄色甚至棕褐色;Gli2蛋白定位于细胞浆，阳性染色时胞浆呈淡黄、棕黄色甚至棕褐色。根据镜下切片染色强度及阳性细胞的占比评分。染色强度：无染色计0分;淡黄色计1分;深黄色计2分;棕褐色计3分。阳性细胞占比<5%计0分;阳性细胞占比为5%～25%计1分;阳性细胞占比为26%～50%计2分;阳性细胞占比为51%～75%计3分;阳性细胞占比为76%～100%计4分。免疫组化评分=染色强度评分×阳性细胞占比评分[4]。免疫组化评分总分为0～12分，分为：阴性（≤1分）、弱阳性（≤3分）、阳性（≤6分）、强阳性（>6分）。免疫组化评分2分及以上者表示阳性表达。
1.5 统计学方法
选用SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析，计量资料用（±s）表示，多组间比较用协方差分析，两两比较用SNK法检验，计数资料用百分比（%）表示，组间比较用χ2检验，Foxm1与Gli2间的关系用Spearman等级相关性检验，检验水准：α=0.05，双侧检验。
2 结 果
2.1 乳腺癌组织、乳腺纤维腺瘤组织及正常乳腺组织中的Foxm1、Gli2蛋白表达情况
Foxm1蛋白在细胞浆和细胞核中均有表达，正常乳腺组织少量表达或无表达，乳腺纤维腺瘤弱陽性表达，乳腺癌组织强阳性表达（见图1）。Gli2蛋白表达于胞浆，正常乳腺组织极少表达或无表达，乳腺纤维腺瘤弱阳性表达，乳腺癌组织表达明显增强（见图2）。乳腺癌组织Foxm1蛋白、Gli2蛋白表达评分高于乳腺纤维腺瘤组织和正常乳腺组织（P<0.05）。见表1。
2.2 Foxm1和Gli2的表达与乳腺癌临床病理特征的关系
Foxm1和Gli2的表达与乳腺癌患者年龄、肿瘤直径、组织学分级、临床分期差异无统计学意义（P>0.05），有淋巴结转移者的乳腺癌组织的Foxm1和Gli2的阳性表达率高于无淋巴结转移者，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
2.3 Foxm1与Gli2表达的关系
Spearman等级相关检验结果显示，Foxm1与Gli2呈正相关（r=0.517，P<0.001）。
3 讨 论
Foxm1为叉头框蛋白家族，是一类具有严格细胞核定位，DNA结合区具有翼状螺旋结构的转录因子。它属于增殖特异性蛋白，可通过调控细胞周期来促进细胞增生和有丝分裂，在静止或未分化细胞中低表达或无表达，而在增殖细胞中高表达[5]。Foxm1的活化过程中是多因子、多细胞信号通路共同参与作用的结果，信号通路包括Hh信号通路和Ras-MAPK信号通路[6]。Hh信号通路是由Hh配体、跨膜蛋白质受体patched和Smoothened组成的受体复合物、下游转录因子Gli蛋白（Gli1、Gli2、Gli3）等组成，它的激活与多种肿瘤的发生、进展及侵袭和转移均密切相关[7]。有研究报道，敲除Gli2基因可使其相关蛋白表达水平降低，且会极大降低Foxm1的表达水平，提示Gli2与Foxm1在肿瘤的发生和进展中可能有一定的关系[8]。Gli2作为Hh信号通路的转录因子之一，对下游多种靶基因的表达具有调控作用，如与细胞增殖、分化有关的基因（cyclin D1）、抗凋亡基因Bcl2等[9]。大量研究报道，在多种恶性肿瘤（如基底细胞癌、前列腺癌、肺癌等）中均有Gli2的异常高表达，其过表达与低预后有关[10]。而且Foxm1作为Hh信号通路的下游靶基因，Hh信号通路活化后可上调Foxm1基因的表达[11]。 盖领等人[12]研究显示，Foxm1在乳腺浸润癌中的表达显著升高，其表达水平与肿瘤直径、临床分期、淋巴结转移密切相关。李周芳等[13]研究指出，Foxm1在乳腺癌细胞增殖过程中起重要的调控作用。本研究结果显示，正常乳腺组织中Foxm1呈低表达或不表达，乳腺纤维腺瘤组织表达量有所增加，而乳腺癌组织中表达量显著增高，染色强度明显强于正常乳腺组织和乳腺纤维腺瘤;而且在乳腺癌组织中，Foxm1虽与患者年龄、肿瘤直径、组织分级及临床分期无明显相关性，但在有淋巴结转移的乳腺癌组织中阳性率明显高于无淋巴结转移者，说明Foxm1蛋白表达上调与乳腺癌淋巴结转移密切相关。本研究同时也发现，Gli2蛋白在乳腺癌组织中的表达水平也明显高于正常乳腺组织和乳腺纤维腺瘤组织，且与淋巴结转移的关系与Foxm1相似。Spearman秩和相关检验结果显示，Foxm1与Gli2呈正相关，这一结果佐证了Gli2作为Hh信号通路的转录因子，其对作为Hh信号通路下游靶基因的Foxm1的表达具有调控作用。 综上所述，Foxm1、Gli2在乳腺癌组织中均高表达，两者存在一定的相关性，可能参与了乳腺癌的发生和侵袭转移过程，因此对两者表达水平进行检测，可能对乳腺癌的诊断及是否转移的评估具有指导意义。
参 考 文 献
[1] 甘绍举，王 青，朱丽敏，等.靶向治疗药物在乳腺癌中的研究进展[J].基础医学与临床，2015，35（1）：134-137.
[2] 周 磊，张萍海，徐 欣，等.下调叉头转录因子M1基因表达对非小细胞肺癌细胞生长与侵袭能力的影响[J].中华医学杂志，2009，89（34）：2424-2426.
[3] 石 超.Gli2通过FoxM1调控KIF20A影响肝癌细胞增殖的分子机制[D].南昌：南昌大学，2015.
[4] 杨建敏，胡静文.Foxm1 蛋白在人宫颈癌组织中的表达及与病理类型、分级、分期之间的关系[J].广东医学，2015，37（14）：2150-2152.
[5] 孔飞飞，袁海花，王炯轶，等.Foxm1对非小细胞肺癌中 MMP-2、MMP-9和迁移侵袭的影响[J].现代肿瘤医学，2014，26（8）：1775-1778.
[6] 冯亚光，魏正强，曾绍兵，等.Gli1和Foxm1在胃癌中的表达及其临床意义[J].中國肿瘤临床，2012，39（7）：377-381.
[7] 陈 丹，陈 红，董良波，等.Gli1与FoxM1在子宫颈癌组织和细胞中的表达及意义[J].武汉大学学报（医学版），2016，37（3）：430-435.
[8] Chen H，Zou Y，Yang H，et al.Downregulation of FoxM1 inhibits proliferation，invasion and angiogenesis of HeLa cells in vitro and in vivo[J].Int J Onc，2014，45（6）：2355-2364.
[9] 林中啸，蔡 铭，虞晓明，等.Gli2在髓母细胞瘤中的表达及其靶向抑制剂的作用与意义[J].医学研究杂志，2015，44（4）：66-70.
[10] Buczkowicz P，Ma J，Hawkins C.GLI2 is a potential therapeutic target in pediatric medulloblastoma[J].J Neur Exp，2011，70（6）：430-437.
[11] 张大伟，曹良启，卢海武，等.Hedgehog 信号通路转录因子Gli2在肝癌组织中的表达及意义[J].中华普通外科学文献（电子版），2013，7（1）：12-16.
[12] 盖 领，茅国新，赵铃铃，等.FOXM1在人乳腺癌组织和MCF-7细胞中的表达及临床意义[J].基础医学与临床，2015，35（8）：1100-1105.
[13] 李周芳，高 伟，李惠翔.FoxM1在乳腺浸润性导管癌组织中的表达[J].肿瘤基础与临床，2013，26（3）：195-197.