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【摘要】 目的：探讨精液体外处理方法及技巧。方法：2010年取卵周期数为1402例实施部分上游法及部分密度梯度离心法；2011年取卵周期数为1667例实施大部分梯度密度离心法+上游法及少部分上游法；2012年取卵周期数为1321例实施全部梯度密度离心+上游法。观察并记录各年份患者受精情况，进行统计学分析，得出结论。结果：本院自2010年-2012年，临床妊娠成功率呈现出逐年上升趋势，结果比较差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：应用密度梯度离心+上游序贯法可使精子的运动参数及形态学均得到明显改善，增加患者妊娠率及保障精子核DNA链完整性，是较好的体外处理精液方法，值得临床推广应用。
【关键词】 精液； 体外处理； 影响结果分析
本文将对本院2010年1月1日-2012年9月30日近三年来进行体外受精-胚胎移植治疗的夫妇进行临床研究，从而探讨精液体外处理方法及技巧，为临床提高体外受精-胚胎移植治疗不孕不育症患者疗效以及优质胚胎率提供可靠依据，现报告结果如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本文将对本院2010年1月1日-2012年9月30日近三年来进行体外受精-胚胎移植治疗的夫妇进行临床研究，其中2010年1402例，男平均（31.4±0.5）岁，女平均（29.7±0.8）岁，不孕不育症平均病程（5.6±0.5）年；2011年1667例，男平均（31.9±0.5）岁，女平均（30.3±0.7）岁，不孕不育症平均病程（5.1±0.8）年；2012年1321例，男平均（32.1±0.6）岁，女平均（30.5±0.8）岁，不孕不育症平均病程（5.2±0.6）年。2010年IVF-ET取卵周期数为1402例、2011年1667例、2012年（1-9月）1321例。
1.2 方法 对2010年1月1日-2012年9月30日近三年来进行体外受精-胚胎移植治疗的夫妇临床资料进行回顾性分析，2010年取卵周期数为1402例实施部分上游法及部分密度梯度离心法对精液进行处理；2011年取卵周期数为1667例实施大部分梯度密度离心法+上游法以及少部分上游法对精液进行处理；2012年取卵周期数为1321例实施全部梯度密度离心+上游法对精液进行处理。观察并记录各年份患者受精情况，进行统计学分析，得出结论。
1.2.1 采樣处理 女方给予常规促排卵方案，于体内卵泡发育成熟后对其肌肉注射人绒毛膜促性腺激素（即hCG）[1]，剂量为5000或10 000 IU，32～36 h后，经阴道超声引导下对女方进行穿刺取卵[2]。男方于女方取卵当日通过手淫法取精液[3]，取精液前男方禁欲3～7 d[4]，将精液收集在无菌塑料杯中液化后待用。
1.2.2 上游法[5] 取将液化后的精液，加入2～3 ml Vitorlife公司生产的HTF洗涤液进行混合，之后以每分钟2000转速度离心3～5 min，弃上清液后加入试管底部并在上层加入2 ml培养液，经浓度为5%、37℃二氧化碳培养箱中上游30～40 min，之后取上清液离心3～5 min，弃上清液后待用。
1.2.3 密度梯度离心+上游序贯法[6] 对精液进行处理，选用Vitorlife公司生产的Isolate梯度分离液，在15 ml圆锥离心管首先将浓度为90%、剂量为1 ml的Isolate分离液注入，之后在其上方加入浓度为45%、剂量为1 ml的Isolate分离液，最上层也轻轻缓慢加入液化的精液，离心速度为每分钟2000转离心10 min弃上清，用剂量为2 ml的HTF洗涤液把上述所得沉淀物轻轻混匀，离心速度为每分钟2000转离心3～5 min弃上清，下悬液加入试管底部，在上面加入2 ml培养液，于浓度为5%、37 ℃二氧化碳培养箱中上游30～40 min将其吸出，每分钟2000转速度离心3～5 min，弃上清后待用。
1.2.4 受精措施 患者取卵完成后，对其进行黄体酮肌肉注射以便支持黄体[7]，于胚胎移植完成2周后进行尿液试验，结果为人绒毛膜促性腺激素呈阳性，于4周后对患者进行B超临床医学影像观察，若患者体内出现妊娠囊及胎心搏动，则可确诊为临床妊娠[8]。
1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
体外受精-胚胎移植治疗结果分析，见表1。由表1可知，本院自2010年-2012年，临床妊娠成功率呈现出逐年上升趋势，结果比较差异具有统计学意义（P<0.05）。
3 讨论
目前临床上常借助辅助生殖技术对不孕不育症患者进行治疗，常规治疗方法为体外受精-胚胎移植（简称IVF-ET）[9]。临床研究表明，对不孕不育症患者进行IVF-ET技术治疗时，由于实施卵浆内单精子注射（简称ICSI）方式，精子将绕过自然选择过程，直接被注入卵母细胞内，因此部分发生遗传物质受损的精子有可能直接注入卵子内部，从而对胚胎发育造成影响，严重时可导致患者孕育后代时出现遗传风险，造成严重后果[10]。
应用精液体外处理注意事项：在取精前数月，男方应戒烟酒，生活有规律，如有生殖系统炎症需积极治疗。进入治疗周期后，根据医嘱在估计取卵前3～7 d，其丈夫需排精一次，然后禁欲，直至取卵日，精液在体内存留时间过长或过短会影响精子质量。首先用清水洗净双手，阴茎，外阴等，然后手淫法留取精液时所用小杯为无菌消毒，留取时不要触摸杯缘及杯内。取精后对其进行液化后应尽快使用，其原因为液化时间过长，精子核易出现空泡现象，影响精子质量，精子核空泡的形状和数目对囊胚的发育有负面影响，精子头部的空泡可能与移植后的流产率相关。由于人精子顶体部含有大量不饱和脂肪酸，并且缺乏抗氧化机制，处理精液时较大的离心力可增加精子产生过多氧自由基（ROS）而损伤精子功能，特别是促使精子的DNA氧化变性，因此在对精液行离心时应尽量减少离心时间及转数，从而尽量避免精液中精子损伤情况发生。 在本次研究过程中对精液应用洗涤液进行洗涤目的为：（1）去除精液中的前列腺素及其他可引起子宮痉挛及疼痛的物质。（2）去除精液中可引起感染及其他副作用的细菌和化学物质。（3）增加了精子的获能，从而增强其受孕能力。（4）有可能去除影响精子功能的抗体。
Pereoll法和Isolate法是临床常用的精液体外梯度密度离心处理方法，但Isolate法处理效果优于Pereoll法，其原因为：（1）Percoll中含有聚乙烯吡咯烷酮在离心过程中可加速精子膜过氧化反应导致DNA完好性受损；（2）Isolate精子分离液是一种非连续液态过滤膜，为二氧化硅以共价键形式交错联结于Hepes-HTF，是经特殊处理的悬浮胶体密度梯度介质，可有效减少细胞污染，与待分离精子不发生反应，不易使顶体膜蛋白失活[3]，具有保护精子DNA结构免受损伤作用，另一方面可能是Isolate所含有的二氧化硅胶体兼作支持体与分子筛的作用，对离心力有缓冲作用，使对精子潜在的氧化损伤降至最低。
参考文献
[1] Dada R，Shamsi M B，Venkatesh S，et al.Attenuatlon of oxidative stress & DNA damage in varicocelectomy：Implications in infertility management[J].Indian J Med Res，2010，132（6）：728-730.
[2]杨俊涛，王亚平，黄国宁，等.两种精子优选法对精子DNA结构完整性及其它参数的影响[J].激光杂志，2009，30（6）：90-91.
[3] Peter R.Brinsden Texmook of In vitro fertilization And Asslsled ReDroductlon[M].北京：人民卫生也版社，2009：22-234.
[4]丁玉芹，姜宏，何瑞冰，等.DNA损伤精子对卵胞质内单精子注射结局的影响[J].安徽医科大学学报，2011，46（2）：173-176.
[5]卢慧，刘玉林，李铮.男性不育临床检测新选择：精子DNA完整性试验[J].中国男科学杂志，2009，23（1）：70-72.
[6]袁韦娜，姜宏，汪存利，等.精子DNA完整性与精子形态的相关性研究[J].生殖医学杂志，2010，19（3）：271-273.
[7]曹云霞.精子染色质完整性检测与辅助生殖技术[J].国际生殖健康/计划生育杂志，2011，30（1）：58-60.
[8]张杨，皮洁.辅助生殖技术中精液处理[J].中国优生与遗传杂志，2010，18（8）：126-127.
[9]乜照燕，吴海峰，张娜，等.男性年龄对精子氧化应激水平、核DNA损伤的影响[J].中国计划生育学杂志，2012，20（1）：30-32.
[10]吴永明，夏欣一，黄宇烽.精子DNA完整性检测技术研究进展[J].中华男科学杂志，2006，12（8）：737-741.
（收稿日期：2013-04-08） （本文编辑：欧丽）
【关键词】 精液； 体外处理； 影响结果分析
本文将对本院2010年1月1日-2012年9月30日近三年来进行体外受精-胚胎移植治疗的夫妇进行临床研究，从而探讨精液体外处理方法及技巧，为临床提高体外受精-胚胎移植治疗不孕不育症患者疗效以及优质胚胎率提供可靠依据，现报告结果如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本文将对本院2010年1月1日-2012年9月30日近三年来进行体外受精-胚胎移植治疗的夫妇进行临床研究，其中2010年1402例，男平均（31.4±0.5）岁，女平均（29.7±0.8）岁，不孕不育症平均病程（5.6±0.5）年；2011年1667例，男平均（31.9±0.5）岁，女平均（30.3±0.7）岁，不孕不育症平均病程（5.1±0.8）年；2012年1321例，男平均（32.1±0.6）岁，女平均（30.5±0.8）岁，不孕不育症平均病程（5.2±0.6）年。2010年IVF-ET取卵周期数为1402例、2011年1667例、2012年（1-9月）1321例。
1.2 方法 对2010年1月1日-2012年9月30日近三年来进行体外受精-胚胎移植治疗的夫妇临床资料进行回顾性分析，2010年取卵周期数为1402例实施部分上游法及部分密度梯度离心法对精液进行处理；2011年取卵周期数为1667例实施大部分梯度密度离心法+上游法以及少部分上游法对精液进行处理；2012年取卵周期数为1321例实施全部梯度密度离心+上游法对精液进行处理。观察并记录各年份患者受精情况，进行统计学分析，得出结论。
1.2.1 采樣处理 女方给予常规促排卵方案，于体内卵泡发育成熟后对其肌肉注射人绒毛膜促性腺激素（即hCG）[1]，剂量为5000或10 000 IU，32～36 h后，经阴道超声引导下对女方进行穿刺取卵[2]。男方于女方取卵当日通过手淫法取精液[3]，取精液前男方禁欲3～7 d[4]，将精液收集在无菌塑料杯中液化后待用。
1.2.2 上游法[5] 取将液化后的精液，加入2～3 ml Vitorlife公司生产的HTF洗涤液进行混合，之后以每分钟2000转速度离心3～5 min，弃上清液后加入试管底部并在上层加入2 ml培养液，经浓度为5%、37℃二氧化碳培养箱中上游30～40 min，之后取上清液离心3～5 min，弃上清液后待用。
1.2.3 密度梯度离心+上游序贯法[6] 对精液进行处理，选用Vitorlife公司生产的Isolate梯度分离液，在15 ml圆锥离心管首先将浓度为90%、剂量为1 ml的Isolate分离液注入，之后在其上方加入浓度为45%、剂量为1 ml的Isolate分离液，最上层也轻轻缓慢加入液化的精液，离心速度为每分钟2000转离心10 min弃上清，用剂量为2 ml的HTF洗涤液把上述所得沉淀物轻轻混匀，离心速度为每分钟2000转离心3～5 min弃上清，下悬液加入试管底部，在上面加入2 ml培养液，于浓度为5%、37 ℃二氧化碳培养箱中上游30～40 min将其吸出，每分钟2000转速度离心3～5 min，弃上清后待用。
1.2.4 受精措施 患者取卵完成后，对其进行黄体酮肌肉注射以便支持黄体[7]，于胚胎移植完成2周后进行尿液试验，结果为人绒毛膜促性腺激素呈阳性，于4周后对患者进行B超临床医学影像观察，若患者体内出现妊娠囊及胎心搏动，则可确诊为临床妊娠[8]。
1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
体外受精-胚胎移植治疗结果分析，见表1。由表1可知，本院自2010年-2012年，临床妊娠成功率呈现出逐年上升趋势，结果比较差异具有统计学意义（P<0.05）。
3 讨论
目前临床上常借助辅助生殖技术对不孕不育症患者进行治疗，常规治疗方法为体外受精-胚胎移植（简称IVF-ET）[9]。临床研究表明，对不孕不育症患者进行IVF-ET技术治疗时，由于实施卵浆内单精子注射（简称ICSI）方式，精子将绕过自然选择过程，直接被注入卵母细胞内，因此部分发生遗传物质受损的精子有可能直接注入卵子内部，从而对胚胎发育造成影响，严重时可导致患者孕育后代时出现遗传风险，造成严重后果[10]。
应用精液体外处理注意事项：在取精前数月，男方应戒烟酒，生活有规律，如有生殖系统炎症需积极治疗。进入治疗周期后，根据医嘱在估计取卵前3～7 d，其丈夫需排精一次，然后禁欲，直至取卵日，精液在体内存留时间过长或过短会影响精子质量。首先用清水洗净双手，阴茎，外阴等，然后手淫法留取精液时所用小杯为无菌消毒，留取时不要触摸杯缘及杯内。取精后对其进行液化后应尽快使用，其原因为液化时间过长，精子核易出现空泡现象，影响精子质量，精子核空泡的形状和数目对囊胚的发育有负面影响，精子头部的空泡可能与移植后的流产率相关。由于人精子顶体部含有大量不饱和脂肪酸，并且缺乏抗氧化机制，处理精液时较大的离心力可增加精子产生过多氧自由基（ROS）而损伤精子功能，特别是促使精子的DNA氧化变性，因此在对精液行离心时应尽量减少离心时间及转数，从而尽量避免精液中精子损伤情况发生。 在本次研究过程中对精液应用洗涤液进行洗涤目的为：（1）去除精液中的前列腺素及其他可引起子宮痉挛及疼痛的物质。（2）去除精液中可引起感染及其他副作用的细菌和化学物质。（3）增加了精子的获能，从而增强其受孕能力。（4）有可能去除影响精子功能的抗体。
Pereoll法和Isolate法是临床常用的精液体外梯度密度离心处理方法，但Isolate法处理效果优于Pereoll法，其原因为：（1）Percoll中含有聚乙烯吡咯烷酮在离心过程中可加速精子膜过氧化反应导致DNA完好性受损；（2）Isolate精子分离液是一种非连续液态过滤膜，为二氧化硅以共价键形式交错联结于Hepes-HTF，是经特殊处理的悬浮胶体密度梯度介质，可有效减少细胞污染，与待分离精子不发生反应，不易使顶体膜蛋白失活[3]，具有保护精子DNA结构免受损伤作用，另一方面可能是Isolate所含有的二氧化硅胶体兼作支持体与分子筛的作用，对离心力有缓冲作用，使对精子潜在的氧化损伤降至最低。
参考文献
[1] Dada R，Shamsi M B，Venkatesh S，et al.Attenuatlon of oxidative stress & DNA damage in varicocelectomy：Implications in infertility management[J].Indian J Med Res，2010，132（6）：728-730.
[2]杨俊涛，王亚平，黄国宁，等.两种精子优选法对精子DNA结构完整性及其它参数的影响[J].激光杂志，2009，30（6）：90-91.
[3] Peter R.Brinsden Texmook of In vitro fertilization And Asslsled ReDroductlon[M].北京：人民卫生也版社，2009：22-234.
[4]丁玉芹，姜宏，何瑞冰，等.DNA损伤精子对卵胞质内单精子注射结局的影响[J].安徽医科大学学报，2011，46（2）：173-176.
[5]卢慧，刘玉林，李铮.男性不育临床检测新选择：精子DNA完整性试验[J].中国男科学杂志，2009，23（1）：70-72.
[6]袁韦娜，姜宏，汪存利，等.精子DNA完整性与精子形态的相关性研究[J].生殖医学杂志，2010，19（3）：271-273.
[7]曹云霞.精子染色质完整性检测与辅助生殖技术[J].国际生殖健康/计划生育杂志，2011，30（1）：58-60.
[8]张杨，皮洁.辅助生殖技术中精液处理[J].中国优生与遗传杂志，2010，18（8）：126-127.
[9]乜照燕，吴海峰，张娜，等.男性年龄对精子氧化应激水平、核DNA损伤的影响[J].中国计划生育学杂志，2012，20（1）：30-32.
[10]吴永明，夏欣一，黄宇烽.精子DNA完整性检测技术研究进展[J].中华男科学杂志，2006，12（8）：737-741.
（收稿日期：2013-04-08） （本文编辑：欧丽）