【摘 要】
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为使大肠杆菌热敏毒素LT的毒素活性丧失的同时仍保留其较强的免疫原性,实验依据LT基因的同源序列设计并合成5条引物,采用突出末端PCR法和重组PCR法,将克隆于质粒pEWD299上的L
【机 构】
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沈阳农业大学生物科技学院,辽宁,沈阳,110161沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁,沈阳,110161;中国人民解放军军需大学军事兽医研究所基因工程实验室,吉林,长春,130062;
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为使大肠杆菌热敏毒素LT的毒素活性丧失的同时仍保留其较强的免疫原性,实验依据LT基因的同源序列设计并合成5条引物,采用突出末端PCR法和重组PCR法,将克隆于质粒pEWD299上的LT基因,分别引入BamHI、Ndel和xhol等位点,扩增出带有上述RE位点且含有m7和mi12突变点的约1100bp和约800bp的DNA片段和不含突变点的约300bp的DNA片段,使控制LT毒力活性中心的第7位和第112位氨基酸的碱基分别发生诱变,各DNA片段经分离、纯化、RE酶切和DNA连接酶连接后,插入经BamHI和Xhol双酶切的线性化的高效表达载体pGEX-4T-1的多克隆位点区,使LTm基因置于pTac强启动子下且与Thrombin蛋白基因融合表达,将连接产物转化入JM105菌株,挑出可疑阳性菌落,提取质粒;经酶切鉴定、PCR鉴定和DNA序列分析,证明读框正确,序列正确,获得了pGEX-4T-1(LTm7和pGEX4T-1(LTm112两个重组表达质粒.为运用基因工程手段大量生产人和动物大肠杆菌流行性腹泻的疫苗抗原和幽门螺杆菌疫苗的粘膜免疫佐剂,完成了基因水平的工作.
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