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摘 要：化学原料药的结构确证是药物研发的基础。文中主要介绍结构确证的常用分析方法，包括元素分析（elemental analysis）、可见-紫外吸收光谱（ultraviolet and visible absorption spectra，UV）、红外吸收光谱（infrared absorption spectrum，IR）、核磁共振谱（nuclear magnetic resonance，NMR）、质谱（mass spectrometry，MS）、X-衍射（X-ray diffraction， XRD）、热分析（Thermal analysis，TA）等，并结合其应用加以讨论。
关键词：原料药;结构确证;分析方法
根据《化学药物原料药制备和结构确证研究的技术指导原则》[1]，原料药的结构确证是药物研发的基础，是保证药学其它方面研究、药理毒理和临床研究能否顺利进行的决定性因素。进行结构确证时，首先应根据化合物的结构特征制订科学、合理、可行的研究方案，并制备符合研究要求的样品，再进行有关的结构确证分析研究，最后对研究结果进行综合解析，确证测试品的结构。
通过结构确证，可以明确药物分子的平面骨架结构，即各原子的连接顺序和方式;明确药物分子的空间构型;确定药物中的结晶水或结晶溶剂含量;明确药物的晶型，即分子在晶体中的排列方式。通过与对照品进行对比，可综合分析原料药样品与对照品是否结构一致。
目前，常用的研究分析方法主要包括元素分析、可见-紫外吸收光谱、红外吸收光谱、核磁共振谱、质谱、X-衍射、热分析等[2]。本综述就以上常见的分析方法及其应用进行总结和讨论。
1.元素分析
通常采用元素分析法，对原料药中存在的元素种类进行鉴定，并获得其含量。分析方法可分为经典化学分析和仪器分析两类。前者主要采用化学方法达到分析目的，后者主要采用化学和物理方法获取结果，这类分析方法往往需要应用特定的仪器，灵敏度高，操作简便快速，发展迅速，但是经典的化学分析方法仍有其重要意义。
对于因药物自身结构特征而难于进行元素分析时，在保证高纯度情况下可采用高分辨质谱方法获得药物元素组成相关信息[3]。
2. 可见-紫外吸收光谱
采用可见-紫外吸收光谱法，在不同波长处吸光度的测定和吸收系数（特别是摩尔吸收系数）的计算，以及对主要吸收谱带的归属分析（如K 带、R 带、E 带、B 带），获得原料药结构中可能含有的发色团、助色团种类以及可能的连接方式等结构信息。当发色团上存在酸性或碱性基团，则需在酸或碱溶液中（常用0.1mol/L HCl 或0.1mol/L NaOH）测试最大吸收波长，观察其紫移或红移现象，进一步分析酸性或碱性基团的存在[4]。另外，采用紫外吸收光谱可检验具有大共轭体系或发色官能团的化合物，作为其他鉴定方法的补充。
3. 红外吸收光谱
有时原料药在紫外波长范围内没有吸收或者吸收微弱，或紫外吸收光谱特征性不强，可采用红外吸收光谱进行分析。红外吸收光谱是利用一束不同波长的红外射线照射到物质的分子上，分子中某个振动频率与红外光的某一频率相同时，分子就吸收此频率光发生振动能级跃迁，形成特殊的光谱。
此法可明确各原子的连接顺序和方式，推测出药物中可能存在的化学键、所含的官能团及其初步的连接方式[5]，亦可给出药物的几何构型、晶型、立体构象等信息。红外吸收光谱具有高度特征性，可与对照品红外吸收光谱进行对比分析鉴定。已有汇集成册的标准红外光谱集出版，可将这些图谱贮存在计算机中，用以对比和检索，进行分析鉴定。
4.核磁共振谱
在外磁场的作用下，具有磁矩的原子核存在着不同能级，当用一定频率的射频照射分子时，可引起原子核自旋能级的跃迁，即产生核磁共振。目前应用最多的是氢核磁共振谱（简称氢谱，1H-NMR）和碳核磁共振谱（简称碳谱，13C-NMR），此外还有二维核磁共振谱，包括H-Hcosy（氢-氢相关谱）、HMBC （碳-氢远程相关谱）、HMQC （碳-氢相关谱）、NOESY（氢-氢化学位移交换谱）等。氢谱主要提供质子类型及其化学环境、氢分布、核间关系，但不能给出不含氢基团的共振信号，难以鉴别化学环境近似的烷烃，且经常出现谱线重叠。碳-13核磁共振谱可给出丰富的碳骨架及有关结构和分子运动的信息，如分子中含有多少个碳原子，它们各属于哪些基团，可以区别伯、仲、叔、季碳原子等。所以氢谱和碳谱互为补充。
采用核磁共振可获得原料药某些元素在分子中的类型、数目、相互连接方式、周围化学环境、甚至空间排列构型、结晶水/结晶溶剂等信息，并推测出化合物相应官能团的连接状况及其初步的结构[6]。
5. 质谱
质谱是利用多种离子化技术，将物质分子转化为离子，按其质荷比（m/z）的差异分离测定，进行物质成分和结构分析的方法。其应用范围广，不受原料药物态限制，且灵敏度高、分析速度快、信息直观、解析方便易行。
质谱分析中，由高分辨质谱获得分子离子峰的质量数，可分析得到原料药的精确相对分子质量;从分子离子峰和碎片離子峰的信息可推测原料药化合物的裂解方式及其分子结构关系;通过同位素峰强比及其分布特征可推算分子中Cl、Br、S等原子数;还可与色谱联用（GC-MS、LC-MS）或质谱联用（MS-MS），为分离、鉴别和定量测定原料药，提供满足结构确证的样品。
6.X-衍射
X-射线衍射方法是研究晶体最有效的工具，对原料药晶型的研究非常理想。常用的方法包括粉末X-衍射（XRPD）和单晶X-衍射（XRSD）。
粉末X-衍射是判断原料药晶型的首选方法，可用于固态单一化合物的鉴别与晶型确定、晶态与非晶态物质的判断，亦可用于原料药（晶型）的稳定性研究。
单晶X-衍射可获得原料药的相对或绝对构型、药物晶型以及原料药中结晶水/结晶溶剂及含量等一系列信息。对于手性原料药结构分析，采用普通的单晶X-衍射不能区分对映体，仅能推导出在空间的相对位置和药物的相对构型。 7.热分析
热分析法是在程序控制温度下，研究物质随温度的变化，发生的晶型转化、熔融、蒸发、脱水等物理变化，或热分解、氧化还原等化学变化，以及伴随发生的温度、能量或重量改变。
最常用的热分析方法有差示热分析（DTA）、热重分析（TGA）、导数热重量法（DTG）、差示扫描量热法（DSC）、热机械分析（TMA）和动态热机械分析（DMA）。采用热分析法处理原料药，可反映原料药的晶型、结晶水/结晶溶剂、物相转化、相容性、热分解和稳定性等信息[7]。
除上述七种常用的结构确证分析方法外，根据原料药结构特征，还可用其他方法加以辅助支持。例如，采用熔点法和光学显微镜法，测定原料药晶型;采用比旋度、圆二色谱推导手性原料药的绝对构型，采用旋光光谱推导相对构型;干燥失重、水分测定获得原料药中的结晶水或结晶溶剂、吸附水或溶剂的含量;结构中含有金属离子以及F、P 等元素的药物，可进行相应金属原子吸收以及F、P 等元素的测定。原料药为多肽，可采用氨基酸分析、质谱、序列分析以及肽图测绘、紫外、红外、核磁共振、多种流动相HPLC、比旋度测定等获得合成多肽的结构信息。
最后将每一种结构确证方法提供的信息进行综合且全面的解析，遵循简明扼要、有机、合理、深入的原则，才能得到原料药完整的结构情况，为原料药后续的研究和应用提供有力可靠的支持。
参考文献
[1] 《化学药物原料药制备和结构确证研究的技术指导原则》，2005
[2] 宁黎丽.化学原料药结构确证的研究思路和方法[J] 中国新药杂志，2008，17（18）：1637-1639.
[3] 朱希，高浩凌，范钢，盛力，沈大冬.头孢妥仑匹酯有关物质的合成及其结构确证[J].中国抗生素杂志，2019，44（1）：83-87.
[4] 张明光，冯小虎，于水涛，吉小龙，陈再新.盐酸贝西沙星的波谱学数据与结构确证[J].波谱学杂志，2018，35（3）：374-384.
[5] 余大海，康旺，郝福，李志刚.卡巴他赛结构确证的波谱学研究[J].波譜学杂志，2017，34（2）：191-199.
[6] 林云良，高红梅，李锋，陈相峰.卢立康唑的波谱学特征和结构确证[J].波谱学杂志，2018，35（3）：385-392.
[7] 董晓亚，雷勇胜，傅琳，杨忠峰，蒋庆峰.伊曲康唑的特性鉴定[J].现代仪器与医疗，2016，22（6）：87-90.
关键词：原料药;结构确证;分析方法
根据《化学药物原料药制备和结构确证研究的技术指导原则》[1]，原料药的结构确证是药物研发的基础，是保证药学其它方面研究、药理毒理和临床研究能否顺利进行的决定性因素。进行结构确证时，首先应根据化合物的结构特征制订科学、合理、可行的研究方案，并制备符合研究要求的样品，再进行有关的结构确证分析研究，最后对研究结果进行综合解析，确证测试品的结构。
通过结构确证，可以明确药物分子的平面骨架结构，即各原子的连接顺序和方式;明确药物分子的空间构型;确定药物中的结晶水或结晶溶剂含量;明确药物的晶型，即分子在晶体中的排列方式。通过与对照品进行对比，可综合分析原料药样品与对照品是否结构一致。
目前，常用的研究分析方法主要包括元素分析、可见-紫外吸收光谱、红外吸收光谱、核磁共振谱、质谱、X-衍射、热分析等[2]。本综述就以上常见的分析方法及其应用进行总结和讨论。
1.元素分析
通常采用元素分析法，对原料药中存在的元素种类进行鉴定，并获得其含量。分析方法可分为经典化学分析和仪器分析两类。前者主要采用化学方法达到分析目的，后者主要采用化学和物理方法获取结果，这类分析方法往往需要应用特定的仪器，灵敏度高，操作简便快速，发展迅速，但是经典的化学分析方法仍有其重要意义。
对于因药物自身结构特征而难于进行元素分析时，在保证高纯度情况下可采用高分辨质谱方法获得药物元素组成相关信息[3]。
2. 可见-紫外吸收光谱
采用可见-紫外吸收光谱法，在不同波长处吸光度的测定和吸收系数（特别是摩尔吸收系数）的计算，以及对主要吸收谱带的归属分析（如K 带、R 带、E 带、B 带），获得原料药结构中可能含有的发色团、助色团种类以及可能的连接方式等结构信息。当发色团上存在酸性或碱性基团，则需在酸或碱溶液中（常用0.1mol/L HCl 或0.1mol/L NaOH）测试最大吸收波长，观察其紫移或红移现象，进一步分析酸性或碱性基团的存在[4]。另外，采用紫外吸收光谱可检验具有大共轭体系或发色官能团的化合物，作为其他鉴定方法的补充。
3. 红外吸收光谱
有时原料药在紫外波长范围内没有吸收或者吸收微弱，或紫外吸收光谱特征性不强，可采用红外吸收光谱进行分析。红外吸收光谱是利用一束不同波长的红外射线照射到物质的分子上，分子中某个振动频率与红外光的某一频率相同时，分子就吸收此频率光发生振动能级跃迁，形成特殊的光谱。
此法可明确各原子的连接顺序和方式，推测出药物中可能存在的化学键、所含的官能团及其初步的连接方式[5]，亦可给出药物的几何构型、晶型、立体构象等信息。红外吸收光谱具有高度特征性，可与对照品红外吸收光谱进行对比分析鉴定。已有汇集成册的标准红外光谱集出版，可将这些图谱贮存在计算机中，用以对比和检索，进行分析鉴定。
4.核磁共振谱
在外磁场的作用下，具有磁矩的原子核存在着不同能级，当用一定频率的射频照射分子时，可引起原子核自旋能级的跃迁，即产生核磁共振。目前应用最多的是氢核磁共振谱（简称氢谱，1H-NMR）和碳核磁共振谱（简称碳谱，13C-NMR），此外还有二维核磁共振谱，包括H-Hcosy（氢-氢相关谱）、HMBC （碳-氢远程相关谱）、HMQC （碳-氢相关谱）、NOESY（氢-氢化学位移交换谱）等。氢谱主要提供质子类型及其化学环境、氢分布、核间关系，但不能给出不含氢基团的共振信号，难以鉴别化学环境近似的烷烃，且经常出现谱线重叠。碳-13核磁共振谱可给出丰富的碳骨架及有关结构和分子运动的信息，如分子中含有多少个碳原子，它们各属于哪些基团，可以区别伯、仲、叔、季碳原子等。所以氢谱和碳谱互为补充。
采用核磁共振可获得原料药某些元素在分子中的类型、数目、相互连接方式、周围化学环境、甚至空间排列构型、结晶水/结晶溶剂等信息，并推测出化合物相应官能团的连接状况及其初步的结构[6]。
5. 质谱
质谱是利用多种离子化技术，将物质分子转化为离子，按其质荷比（m/z）的差异分离测定，进行物质成分和结构分析的方法。其应用范围广，不受原料药物态限制，且灵敏度高、分析速度快、信息直观、解析方便易行。
质谱分析中，由高分辨质谱获得分子离子峰的质量数，可分析得到原料药的精确相对分子质量;从分子离子峰和碎片離子峰的信息可推测原料药化合物的裂解方式及其分子结构关系;通过同位素峰强比及其分布特征可推算分子中Cl、Br、S等原子数;还可与色谱联用（GC-MS、LC-MS）或质谱联用（MS-MS），为分离、鉴别和定量测定原料药，提供满足结构确证的样品。
6.X-衍射
X-射线衍射方法是研究晶体最有效的工具，对原料药晶型的研究非常理想。常用的方法包括粉末X-衍射（XRPD）和单晶X-衍射（XRSD）。
粉末X-衍射是判断原料药晶型的首选方法，可用于固态单一化合物的鉴别与晶型确定、晶态与非晶态物质的判断，亦可用于原料药（晶型）的稳定性研究。
单晶X-衍射可获得原料药的相对或绝对构型、药物晶型以及原料药中结晶水/结晶溶剂及含量等一系列信息。对于手性原料药结构分析，采用普通的单晶X-衍射不能区分对映体，仅能推导出在空间的相对位置和药物的相对构型。 7.热分析
热分析法是在程序控制温度下，研究物质随温度的变化，发生的晶型转化、熔融、蒸发、脱水等物理变化，或热分解、氧化还原等化学变化，以及伴随发生的温度、能量或重量改变。
最常用的热分析方法有差示热分析（DTA）、热重分析（TGA）、导数热重量法（DTG）、差示扫描量热法（DSC）、热机械分析（TMA）和动态热机械分析（DMA）。采用热分析法处理原料药，可反映原料药的晶型、结晶水/结晶溶剂、物相转化、相容性、热分解和稳定性等信息[7]。
除上述七种常用的结构确证分析方法外，根据原料药结构特征，还可用其他方法加以辅助支持。例如，采用熔点法和光学显微镜法，测定原料药晶型;采用比旋度、圆二色谱推导手性原料药的绝对构型，采用旋光光谱推导相对构型;干燥失重、水分测定获得原料药中的结晶水或结晶溶剂、吸附水或溶剂的含量;结构中含有金属离子以及F、P 等元素的药物，可进行相应金属原子吸收以及F、P 等元素的测定。原料药为多肽，可采用氨基酸分析、质谱、序列分析以及肽图测绘、紫外、红外、核磁共振、多种流动相HPLC、比旋度测定等获得合成多肽的结构信息。
最后将每一种结构确证方法提供的信息进行综合且全面的解析，遵循简明扼要、有机、合理、深入的原则，才能得到原料药完整的结构情况，为原料药后续的研究和应用提供有力可靠的支持。
参考文献
[1] 《化学药物原料药制备和结构确证研究的技术指导原则》，2005
[2] 宁黎丽.化学原料药结构确证的研究思路和方法[J] 中国新药杂志，2008，17（18）：1637-1639.
[3] 朱希，高浩凌，范钢，盛力，沈大冬.头孢妥仑匹酯有关物质的合成及其结构确证[J].中国抗生素杂志，2019，44（1）：83-87.
[4] 张明光，冯小虎，于水涛，吉小龙，陈再新.盐酸贝西沙星的波谱学数据与结构确证[J].波谱学杂志，2018，35（3）：374-384.
[5] 余大海，康旺，郝福，李志刚.卡巴他赛结构确证的波谱学研究[J].波譜学杂志，2017，34（2）：191-199.
[6] 林云良，高红梅，李锋，陈相峰.卢立康唑的波谱学特征和结构确证[J].波谱学杂志，2018，35（3）：385-392.
[7] 董晓亚，雷勇胜，傅琳，杨忠峰，蒋庆峰.伊曲康唑的特性鉴定[J].现代仪器与医疗，2016，22（6）：87-90.