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【摘 要】本文采用高校液相测定了复方氨基酸注射液中酪氨酸和色氨酸的含量，固定相为：安捷伦Cl8（4.6mm×250mm，5um），甲醇-乙腈-0.1%醋酸钠水溶液（3：5：92）为流动相，检测波长为280nm；色氨酸在50～150μg·mL-1范围内呈良好的线性关系；酪氨酸在100～900μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。色氨酸和酪氨酸的平均回收率分别为99.5%、99.5%，RSD为0.63%（n=6）、0.56%（n=6）；此方法简便、准确、重现性好，可用于复方氨基酸注射液中色氨酸和酪氨酸的含量测定。
【关键词】复方氨基酸注射液；色氨酸；酪氨酸
复方氨基酸注射液是一种透明、无色或微黄色的澄明液体，可提供完全、平衡的18种必需和非必需氨基酸，改善氮平衡。复方氨基酸注射液具有促进人体蛋白质代谢正常，纠正负氮平衡，补充蛋白质，加快伤口愈合的作用。复方氨基酸注射液用于大面积烧伤、创伤及严重感染等应激状态下肌肉分解代谢亢进、消化系统功能障碍、营养恶化及免疫功能下降的病人的营养支持。复方氨基酸注射液含有L-脯氨酸（C5H9NO2）、L-组氨酸（C6H9N3O2）、L-色氨酸（C11H12N2O2）、L-丝氨酸（C3H7NO3）、L-丙氨酸（C3H7NO2）、L-精氨酸（C6H14N4O2）、L-缬氨酸等。本文采用高校液相测定了复方氨基酸注射液中酪氨酸和色氨酸的含量。
1.仪器与试药
WP-UP-Ⅱ-30分析型实验室专用超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司）；FL2200-2高效液相色谱仪（浙江福立分析仪器有限公司）；CO-1000型色谱柱温箱（武汉恒信世纪科技有限公司）；B8510E-DTH超声波清洗机（必能信超声（上海）有限公司）；320 XT 电子分析天平（上海精科天美贸易有限公司）；U-1901 双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。色氨酸和酪氨酸对照品由中国药品生物制品检定所提供。乙腈（武汉莱恩化工有限责任公司）、甲醇（武汉莱恩化工有限责任公司）、醋酸钠（郑州世纪凯美化工产品有限公司）、四氢呋喃（襄樊金译成精细化工有限公司）、三乙胺（福建省福州市汇丰化工有限公司）、磷酸二氢钠（东莞市多正化工有限公司）、磷酸（郑州世纪凯美化工产品有限公司）。
2.含量测定
2.1色谱条件
依据查阅文献及考查的结果[1-12]，确定色谱条件如下。色谱柱为安捷伦Cl8规格为（4.6mm×250mm，5um）；甲醇-乙腈-0.1%醋酸钠水溶液（3：5：92）为流动相；检测波长为280nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。理论板数按酪氨酸峰计算应不得低于2000。
2.2供试品溶液的制备
取复方氨基酸注射液适量，精密量取，置50mL量瓶中，加流动相适量，超声处理十分钟使溶解，放置至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。
2.3对照品溶液的制备
分别精密称取酪氨酸和色氨酸对照品约5mg和50mg，置100mL容量瓶中，用加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL溶液中分别含酪氨酸50μg和色氨酸500μg）。
2.4标准曲线的制备
制备浓度为50μg·mL-1、60μg·mL-1、70μg·mL-1、80μg·mL-1、90μg·mL-1、100μg·mL-1、110μg·mL-1、120μg·mL-1、130μg·mL-1、150μg·mL-1的色氨酸对照品溶液，制备浓度为100μg·mL-1、200μg·mL-1、300μg·mL-1、400μg·mL-1、500μg·mL-1、600μg·mL-1、700μg·mL-1、800μg·mL-1、900μg·mL-1的酪氨酸对照品溶液。分别按色氨酸、酪氨酸的测定参数继续测定。以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，色氨酸在50～150μg·mL-1范围内呈良好的线性关系；酪氨酸在100～900μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。
2.5精密度试验
依照2.3项下制备对照品溶液，分别精密吸取色氨酸和酪氨酸对照品溶液重复测定6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD分别为0.51%和0.53%。结果表明，本实验精密度良好。
2.6重现性试验
分别称取同批复方氨基酸注射液样品6份，分别依照2.3项下供试品制备方法制备供试品，按质量标准含量测定项下方法测定含量，并计算样品的RSD值，RSD值为0.77%，0.68%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。
2.7稳定性试验
依照2.3项下供试品制备方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，8，10h进样测定，供试品色氨酸和酪氨酸峰面积的RSD分别为0.69%和0.76%。结果表明色氨酸和酪氨酸至少在10h内稳定。
2.8回收率试验
采用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各6份，分精密添加一定量的色氨酸和酪氨酸对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量，计算回收率。6次测定的平均回收率分别为99.5%和99.5%，RSD分别为0.63%和0.55%。
2.9样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定复方氨基酸注射液三批样品中色氨酸和酪氨酸的含量，结果三批样品的色氨酸和酪氨酸含量分别为标示量的99.6%、100.1%、99.5%和99.5%、99.6%、100.2%。
3.讨论
分别考察甲醇-乙腈-0.1%醋酸钠水溶液（5：10：85），甲醇-四氢呋喃-0.075mol/L醋酸钠缓冲液（pH4.5）（30：20：50），乙腈-四氢呋喃-三乙胺磷酸缓冲液（25：15：60），甲醇-乙腈-0.1%醋酸钠水溶液（3：5：92），甲醇-乙腈-水（40：40：20），10.25mol/L醋酸锌-50mmol/L醋酸溶液（含3%乙腈），乙腈-0.1%醋酸钠水溶液（8：92）不同比例的流动相，结果以甲醇-乙腈-0.1%醋酸钠水溶液（3：5：92）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用甲醇-乙腈-0.1%醋酸钠水溶液（3：5：92）为流动相。复方氨基酸注射液中色氨酸和酪氨酸的含量为标示量的95%-105%。 [科]
【参考文献】
[1]张波，刘云洁，全先高.发酵液中色氨酸含量的HPLC法测定[J].济宁医学院学报，2009（02）.
[2]陈永波，饶斌，覃兰.高效液相色谱法快速直接测定酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸[J].氨基酸和生物资源，2000（01）.
[3]徐雪梅，夏晓萍.高效液相色谱法测定孕妇血清中色氨酸及其代谢产物Kynurenine[J].浙江中医药大学学报，2007（02）.
[4]张带荣.高效液相色谱荧光法测定紫苏子中色氨酸[J].中国医院药学杂志，2008（15）.
[5]王瑞，唐爱国，郑荣，李江，皮兰敢.健康国人血清犬尿氨酸和犬尿氨酸/色氨酸含量比值参考值范围的建立[J].中华检验医学杂志，2006（10）.
[6]柳兴其，王清平，唐爱国.两种高效液相色谱法测定血清色氨酸的结果比较[J].实用预防医学，2004（04）.
[7]任大喜，提伟钢，李景红，霍贵成.荧光法测定婴儿奶粉中色氨酸的含量[J].食品工业科技，2007（07）.
[8]王瑞，唐爱国.高效液相色谱法同时测定血清中的犬尿氨酸和色氨酸[J].色谱，2006（02）.
[9]周前选，唐爱国，任亚萍，项忠元.高效液相色谱-荧光法同时测定血清5-羟色胺和色氨酸方法的建立[J].实用预防医学，2010（02）.
[10]李多伟，张小燕，孙诗清，王义潮. RP-HPLC法测定5-羟基色氨酸[J].分析试验室，2006（05）.
[11]杨文军，张丽英，常碧影，白璐，苏哲.反相液相色谱法测定血清中L-色氨酸及其代谢产物[J].现代科学仪器，2004（04）.
[12]肖乐东，唐爱国，莫喜明，罗昔波，皮兰敢.高效液相色谱-荧光检测法同时测定血清中的犬尿氨酸和犬尿喹啉酸[J].色谱，2009（02）.
【关键词】复方氨基酸注射液；色氨酸；酪氨酸
复方氨基酸注射液是一种透明、无色或微黄色的澄明液体，可提供完全、平衡的18种必需和非必需氨基酸，改善氮平衡。复方氨基酸注射液具有促进人体蛋白质代谢正常，纠正负氮平衡，补充蛋白质，加快伤口愈合的作用。复方氨基酸注射液用于大面积烧伤、创伤及严重感染等应激状态下肌肉分解代谢亢进、消化系统功能障碍、营养恶化及免疫功能下降的病人的营养支持。复方氨基酸注射液含有L-脯氨酸（C5H9NO2）、L-组氨酸（C6H9N3O2）、L-色氨酸（C11H12N2O2）、L-丝氨酸（C3H7NO3）、L-丙氨酸（C3H7NO2）、L-精氨酸（C6H14N4O2）、L-缬氨酸等。本文采用高校液相测定了复方氨基酸注射液中酪氨酸和色氨酸的含量。
1.仪器与试药
WP-UP-Ⅱ-30分析型实验室专用超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司）；FL2200-2高效液相色谱仪（浙江福立分析仪器有限公司）；CO-1000型色谱柱温箱（武汉恒信世纪科技有限公司）；B8510E-DTH超声波清洗机（必能信超声（上海）有限公司）；320 XT 电子分析天平（上海精科天美贸易有限公司）；U-1901 双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。色氨酸和酪氨酸对照品由中国药品生物制品检定所提供。乙腈（武汉莱恩化工有限责任公司）、甲醇（武汉莱恩化工有限责任公司）、醋酸钠（郑州世纪凯美化工产品有限公司）、四氢呋喃（襄樊金译成精细化工有限公司）、三乙胺（福建省福州市汇丰化工有限公司）、磷酸二氢钠（东莞市多正化工有限公司）、磷酸（郑州世纪凯美化工产品有限公司）。
2.含量测定
2.1色谱条件
依据查阅文献及考查的结果[1-12]，确定色谱条件如下。色谱柱为安捷伦Cl8规格为（4.6mm×250mm，5um）；甲醇-乙腈-0.1%醋酸钠水溶液（3：5：92）为流动相；检测波长为280nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。理论板数按酪氨酸峰计算应不得低于2000。
2.2供试品溶液的制备
取复方氨基酸注射液适量，精密量取，置50mL量瓶中，加流动相适量，超声处理十分钟使溶解，放置至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。
2.3对照品溶液的制备
分别精密称取酪氨酸和色氨酸对照品约5mg和50mg，置100mL容量瓶中，用加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL溶液中分别含酪氨酸50μg和色氨酸500μg）。
2.4标准曲线的制备
制备浓度为50μg·mL-1、60μg·mL-1、70μg·mL-1、80μg·mL-1、90μg·mL-1、100μg·mL-1、110μg·mL-1、120μg·mL-1、130μg·mL-1、150μg·mL-1的色氨酸对照品溶液，制备浓度为100μg·mL-1、200μg·mL-1、300μg·mL-1、400μg·mL-1、500μg·mL-1、600μg·mL-1、700μg·mL-1、800μg·mL-1、900μg·mL-1的酪氨酸对照品溶液。分别按色氨酸、酪氨酸的测定参数继续测定。以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，色氨酸在50～150μg·mL-1范围内呈良好的线性关系；酪氨酸在100～900μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。
2.5精密度试验
依照2.3项下制备对照品溶液，分别精密吸取色氨酸和酪氨酸对照品溶液重复测定6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD分别为0.51%和0.53%。结果表明，本实验精密度良好。
2.6重现性试验
分别称取同批复方氨基酸注射液样品6份，分别依照2.3项下供试品制备方法制备供试品，按质量标准含量测定项下方法测定含量，并计算样品的RSD值，RSD值为0.77%，0.68%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。
2.7稳定性试验
依照2.3项下供试品制备方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，8，10h进样测定，供试品色氨酸和酪氨酸峰面积的RSD分别为0.69%和0.76%。结果表明色氨酸和酪氨酸至少在10h内稳定。
2.8回收率试验
采用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各6份，分精密添加一定量的色氨酸和酪氨酸对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量，计算回收率。6次测定的平均回收率分别为99.5%和99.5%，RSD分别为0.63%和0.55%。
2.9样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定复方氨基酸注射液三批样品中色氨酸和酪氨酸的含量，结果三批样品的色氨酸和酪氨酸含量分别为标示量的99.6%、100.1%、99.5%和99.5%、99.6%、100.2%。
3.讨论
分别考察甲醇-乙腈-0.1%醋酸钠水溶液（5：10：85），甲醇-四氢呋喃-0.075mol/L醋酸钠缓冲液（pH4.5）（30：20：50），乙腈-四氢呋喃-三乙胺磷酸缓冲液（25：15：60），甲醇-乙腈-0.1%醋酸钠水溶液（3：5：92），甲醇-乙腈-水（40：40：20），10.25mol/L醋酸锌-50mmol/L醋酸溶液（含3%乙腈），乙腈-0.1%醋酸钠水溶液（8：92）不同比例的流动相，结果以甲醇-乙腈-0.1%醋酸钠水溶液（3：5：92）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用甲醇-乙腈-0.1%醋酸钠水溶液（3：5：92）为流动相。复方氨基酸注射液中色氨酸和酪氨酸的含量为标示量的95%-105%。 [科]
【参考文献】
[1]张波，刘云洁，全先高.发酵液中色氨酸含量的HPLC法测定[J].济宁医学院学报，2009（02）.
[2]陈永波，饶斌，覃兰.高效液相色谱法快速直接测定酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸[J].氨基酸和生物资源，2000（01）.
[3]徐雪梅，夏晓萍.高效液相色谱法测定孕妇血清中色氨酸及其代谢产物Kynurenine[J].浙江中医药大学学报，2007（02）.
[4]张带荣.高效液相色谱荧光法测定紫苏子中色氨酸[J].中国医院药学杂志，2008（15）.
[5]王瑞，唐爱国，郑荣，李江，皮兰敢.健康国人血清犬尿氨酸和犬尿氨酸/色氨酸含量比值参考值范围的建立[J].中华检验医学杂志，2006（10）.
[6]柳兴其，王清平，唐爱国.两种高效液相色谱法测定血清色氨酸的结果比较[J].实用预防医学，2004（04）.
[7]任大喜，提伟钢，李景红，霍贵成.荧光法测定婴儿奶粉中色氨酸的含量[J].食品工业科技，2007（07）.
[8]王瑞，唐爱国.高效液相色谱法同时测定血清中的犬尿氨酸和色氨酸[J].色谱，2006（02）.
[9]周前选，唐爱国，任亚萍，项忠元.高效液相色谱-荧光法同时测定血清5-羟色胺和色氨酸方法的建立[J].实用预防医学，2010（02）.
[10]李多伟，张小燕，孙诗清，王义潮. RP-HPLC法测定5-羟基色氨酸[J].分析试验室，2006（05）.
[11]杨文军，张丽英，常碧影，白璐，苏哲.反相液相色谱法测定血清中L-色氨酸及其代谢产物[J].现代科学仪器，2004（04）.
[12]肖乐东，唐爱国，莫喜明，罗昔波，皮兰敢.高效液相色谱-荧光检测法同时测定血清中的犬尿氨酸和犬尿喹啉酸[J].色谱，2009（02）.