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摘要[目的]比较副猪嗜血杆菌国内流行血清型菌株感染后小鼠外周血淋巴细胞、血清细胞因子及免疫球蛋白水平的变化情况。[方法]将72只小鼠分为4组，分别腹腔注射副猪嗜血杆菌血清型4、5和12菌株，检测3 d 、7 d和15 d各组外周血T、B淋巴细胞及血清细胞因子和Ig水平。[结果]副猪嗜血杆菌感染小鼠3 d，T、B淋巴细胞数量明显高于对照组，而随着感染时间的延长而逐渐下降。IgG、IFN-γ和IL-10水平随感染时间的延长而逐渐增高，而IgA、IgM和IgE水平逐渐降低。感染3 d，Th1/Th2比值稍有下降，而Th1/Th2比值随着感染时间的延长而逐渐升高，明显高于对照组。不同血清型感染在各时间点之间T、B淋巴细胞、IgA、IgM、IgE、IFN-γ、IL-10和Th1/Th2差异均无统计学意义，而血清型4和5感染组小鼠血清IgG均明显高于血清型12组。[结论]除IgG以外，副猪嗜血杆菌国内流行血清型4、5和12菌株感染小鼠后外周血淋巴细胞、血清细胞因子及Ig水平无明显差异。
关键词副猪嗜血杆菌；血清型；淋巴细胞；细胞因子；免疫球蛋白
中图分类号S855.1+2文献标识码A文章编号0517-6611（2016）16-164-03
Abstract[Objective] To comparatively study on level of peripheral blood lymphocytes， cytokines， and immunoglobulins （Ig） in mice infected with the epidemic serotypes Haemophilus parasuis in China. [Method] 72 mice were subdivided into four groups， group serotypes 4， 5， 12， and PBS （control group）， and were injected intraperitoneally with Haemophilus parasuis serotypes 4， 5， 12， and PBS. T lymphocytes and B lymphocytes， cytokines， and Ig were detected. [Result] The number of T lymphocytes and B lymphocytes in mice on 3 days after infection with Haemophilus parasuis， and gradually decreased as increasing time. But gradually increased in the level of IgG， IFNγ， and IL10， and gradually decreased in the level of IgA， IgM， and IgE. The Th1/Th2 level was gradually increased as increasing time， and significantly higher than the control group. However， there were no significant differences between different serotypes Haemophilus parasuis in the level of T lymphocytes and B lymphocytes， IgA， IgM， IgE， IFNγ， IL10， and Th1/Th2， but the level of IgG in group serotypes 4 and 5 were significantly higher than group serotypes 12. [Conclusion] There were no significant differences in the level of peripheral blood lymphocytes， cytokines， and Ig except IgG in mice infected with Haemophilus parasuis serotypes 4， 5， 12 in China.
Key wordsHaemophilus parasuis； Serotypes； Lymphocytes； Cytokines； Immunoglobulins
副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）引起的猪多发性浆膜炎、关节炎或败血症[1]。该病发病率一般为30%～40%，死亡率可高达50%以上，给养猪业带来巨大的经济损失[2]。副猪嗜血杆菌是一种革兰氏阴性小杆菌，根据Kieletein-Rapp-Gabriedson琼脂扩散血清分型方法，将副猪嗜血杆菌至少分为15个血清型[3]，由于副猪嗜血杆菌血清型复杂，目前仍有20%以上的临床分离株无法定型。虽然疫苗免疫被认为是防控副猪嗜血杆菌病暴发与流行的最有效手段，但由于副猪嗜血杆菌血清型众多，其免疫效果并不理想。因此，弄清不同血清型副猪嗜血杆菌对机体免疫的影响就显得尤为重要。机体免疫功能的变化预示着疾病发展的方向。笔者研究了副猪嗜血杆菌国内流行血清型菌株感染小鼠后的机体相关免疫指标的变化情况，旨在为进一步研究副猪嗜血杆菌提供参考数据。
1材料与方法
1.1实验动物6～8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，体重（20±2） g，购自郑州大学实验动物研究中心。
1.2菌株副猪嗜血杆菌血清型4、5和12菌株，由河南科技大学微生物基因工程实验室保存。
1.3试剂与仪器 1.3.1试剂。胰蛋白大豆琼脂（Tryptic soy agar，TSA）和胰蛋白大豆肉汤（Tryptic soy broth，TSB），均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；新生牛血清，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD），购自瑞士Roche公司；CD3、CD19抗体及IgG、IgA、IgM和IgE ELISA检测试剂盒，均购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司。
1.3.2仪器。试验仪器有无菌操作台、超纯水仪、微量移液枪、数码水热恒温培养箱、恒温摇床、高压蒸汽灭菌锅、酶标仪、流甙细胞仪等。
1.4细菌复苏与培养将副猪嗜血杆菌血清型4、5和12菌株划线于含10%新生牛血清和20 μg/mL NAD的TSA平板培养过夜，然后将单菌落接种于含10%新生牛血清和20 μg/mL NAD的TSB液体培养基中，37 ℃下振荡培养24 h。
1.5动物感染与样本收集将72只小鼠随机分成4组：PBS对照组、血清型4组、血清型5组和血清型12组，分别腹腔接种PBS、副猪嗜血杆菌血清型4、5和12。于感染3、7和15 d后采用摘眼球法收集各组小鼠血液，将其分成2份：1份样品进行抗凝处理，用于T、B淋巴细胞检测分析；另1份收集血清，用于免疫球蛋白检测。
1.6T淋巴细胞检测样品中加入1.5 mL红细胞裂解液，室温孵育15 min后1 500 r/min离心5 min，PBS重悬。50 μL抗凝血与20 μL FITC-CD3抗体混匀后，避光孵育15 min。弃上清液后，用PBS清洗细胞1次，PBS重悬后上流式细胞仪分析。
1.7B淋巴细胞检测 使用全自动细胞计数仪检测全血总淋巴细胞数，同时使用流式细胞仪检测B淋巴细胞，在100 μL抗凝血中分别加入20 μL FITC-CD19、PE-CD3及同型阴性对照，避光孵育30 min，加入红细胞裂解液，室温孵育10 min，1 000 r/min离心5 min弃去上清，PBS重悬后上流式细胞仪分析。
1.8免疫球蛋白检测按照ELISA试剂盒说明书检测各组IgG、IgA、IgM和IgE水平。
1.9Th1/Th2比值检测按照ELISA试剂盒说明书检测各组小鼠血清IFN-γ和IL-10含量，以IFN-γ代表Th1，以IL-10代表Th2，计算Th1/Th2比值。
1.10数据统计与分析所有试验数据以平均值±标准差（±s）表示，使用SPSS 19.0统计软件对试验数据进行统计与分析，组间比较采用t检验，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
2结果与分析
2.1副猪嗜血杆菌感染不同时间点小鼠T、B淋巴细胞检测 由表1可知，感染3 d各感染组T、B淋巴细胞数量明显高于对照组（P<0.01）；感染7 d，各感染组T、B淋巴细胞数量有所下降，但均高于对照组（P<0.05）。感染15 d，各感染组T、B淋巴细胞数量极显著低于对照组（P<0.01）。不同血清型感染在不同时间点之间差异均无统计学意义。
2.2副猪嗜血杆菌感染不同时间点小鼠免疫球蛋白检测 由表2可知，各个时间点各感染组血清IgG与对照组相比均显著增高（P<0.01），且随着感染时间的延长，感染组IgG水平逐渐增高。感染组IgA、IgM和IgE水平与对照组相比具有一致性的变化趋势，即感染3 d各感染组IgA、IgM和IgE水平明显高于对照组（P<0.01），但其随着感染时间的延长呈逐渐下降趋势（P<0.01或P<0.05），其中15 d各感染组IgM和IgE水平降至正常水平（P<0.05）。各时间点血清型4和5感染组小鼠血清IgG均明显高于血清型12组（P<0.01）。
2.3副猪嗜血杆菌感染不同时间点小鼠Th1/Th2比值检测由表3可知，各组不同时间点IFN-γ和IL-10水平与对照组相比均明显升高（P<0.01）。感染3 d各感染组Th1/Th2比值稍有下降，但与对照组相比差异无统计学意义，而随着感染时间的延长，各感染组Th1/Th2比值逐渐升高，7 d和15 d各感染组Th1/Th2比值均明显高于对照组（P<0.05或P<0.01）。不同血清型感染在不同时间点之间IFN-γ和IL-10水平及Th1/Th2比值差异均无统计学意义。
3讨论与结论
淋巴细胞是机体主要免疫细胞，其数量变化可以反映机体的细胞免疫水平。CD3和CD19分别是T、B淋巴细胞表面的特异抗原，可以反映总T、B淋巴细胞的量[4]。该研究结果表明，副猪嗜血杆菌感染小鼠3 d T、B淋巴细胞数量明显增高，且随着感染时间的延长呈逐渐下降的趋势，但不同血清型感染各时间点之间均无明显差异。Ig是指B淋巴细胞或记忆细胞在外源物质刺激下增殖分化成的浆细胞所产生的一类蛋白质，主要分布在血清、组织液及外分泌液中。健康人血清中的Ig含量是恒定的，Ig在机体防御中发挥着重要作用。病原微生物感染机体后产生大量的Ig，以抵抗感染。该研究结果表明副猪嗜血杆菌感染小鼠后IgG水平随感染时间的延长而逐渐增高，而感染组IgA、IgM和IgE水平呈逐渐降低的趋势。但是，各时间点血清型4和5感染组小鼠血清IgG水平均明显高于血清型12组。这可能是因为副猪嗜血杆菌血清型12具有不同于血清型4和5的一些功能蛋白，所激发机体分泌产生抗体的水平不一致。
细胞因子是指一类由T细胞、B细胞、单核/巨噬细胞、NK细胞等免疫细胞和内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等某些非免疫细胞经外源物质刺激后合成、分泌的蛋白质或小分子多肽，这类小分子物质具有广泛生物学活性[5]。作为免疫系统中细胞间相互作用的信号分子，与细胞膜上受体结合后发挥多种生物效应，在调节免疫应答和炎症反应中起重要作用。根据在感染和炎症反应中的功能作用，又可将其分为促炎性细胞因子（IL-1、IL -8、TNF-α和IFN-γ等）和抑炎性细胞因子（IL-1rα、IL-4和IL-10等）2大类。该研究结果表明副猪嗜血杆菌感染小鼠血清IFN-γ和IL-10水平明显升高，但不同血清型之间差异无明显变化。正常情况下，机体Th1和Th2细胞功能均处于动态平衡状态，维持机体正常的细胞免疫和体液免疫功能。该研究结果表明感染3 d Th1/Th2比值稍有下降，而Th1/Th2比值随着感染时间的延长而逐渐升高，在7 d和15 d各感染组Th1/Th2比值均明显高于对照组，但不同血清型之间差异无明显变化。
安徽农业科学2016年参考文献
[1] MACEDO N，ROVIRA A，TORREMORELL M.Haemophilus parasuis：Infection，immunity and enrofloxacin [J].Vet Res，2015，46：128.
[2] KUEHN J S，REGISTER K B，PHILLIPS G J.Draft genome sequences for 10 isolates of the swine pathogen Haemophilus parasuis[J].Genome announc，2013，1（5）：739-752.
[3] KIELSTEIN P，RAPPGABRIELSON V J.Designation of 15 serovars of Haemophilus parasuis on the basis of immunodiffusion using heatstable antigen extracts [J].J Clin Microbiol，1992，30（4）：826-865.
[4] 张有聪，刘淑英.T淋巴细胞和B淋巴细胞的研究进展[J].畜牧与饲料科学（奶牛版），2006，1（6）：75-78.
[5] 高玲美，牛钟相，丁淑燕.动物细胞因子研究进展[J].动物医学进展，2003，24（4）：46-48.
关键词副猪嗜血杆菌；血清型；淋巴细胞；细胞因子；免疫球蛋白
中图分类号S855.1+2文献标识码A文章编号0517-6611（2016）16-164-03
Abstract[Objective] To comparatively study on level of peripheral blood lymphocytes， cytokines， and immunoglobulins （Ig） in mice infected with the epidemic serotypes Haemophilus parasuis in China. [Method] 72 mice were subdivided into four groups， group serotypes 4， 5， 12， and PBS （control group）， and were injected intraperitoneally with Haemophilus parasuis serotypes 4， 5， 12， and PBS. T lymphocytes and B lymphocytes， cytokines， and Ig were detected. [Result] The number of T lymphocytes and B lymphocytes in mice on 3 days after infection with Haemophilus parasuis， and gradually decreased as increasing time. But gradually increased in the level of IgG， IFNγ， and IL10， and gradually decreased in the level of IgA， IgM， and IgE. The Th1/Th2 level was gradually increased as increasing time， and significantly higher than the control group. However， there were no significant differences between different serotypes Haemophilus parasuis in the level of T lymphocytes and B lymphocytes， IgA， IgM， IgE， IFNγ， IL10， and Th1/Th2， but the level of IgG in group serotypes 4 and 5 were significantly higher than group serotypes 12. [Conclusion] There were no significant differences in the level of peripheral blood lymphocytes， cytokines， and Ig except IgG in mice infected with Haemophilus parasuis serotypes 4， 5， 12 in China.
Key wordsHaemophilus parasuis； Serotypes； Lymphocytes； Cytokines； Immunoglobulins
副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）引起的猪多发性浆膜炎、关节炎或败血症[1]。该病发病率一般为30%～40%，死亡率可高达50%以上，给养猪业带来巨大的经济损失[2]。副猪嗜血杆菌是一种革兰氏阴性小杆菌，根据Kieletein-Rapp-Gabriedson琼脂扩散血清分型方法，将副猪嗜血杆菌至少分为15个血清型[3]，由于副猪嗜血杆菌血清型复杂，目前仍有20%以上的临床分离株无法定型。虽然疫苗免疫被认为是防控副猪嗜血杆菌病暴发与流行的最有效手段，但由于副猪嗜血杆菌血清型众多，其免疫效果并不理想。因此，弄清不同血清型副猪嗜血杆菌对机体免疫的影响就显得尤为重要。机体免疫功能的变化预示着疾病发展的方向。笔者研究了副猪嗜血杆菌国内流行血清型菌株感染小鼠后的机体相关免疫指标的变化情况，旨在为进一步研究副猪嗜血杆菌提供参考数据。
1材料与方法
1.1实验动物6～8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，体重（20±2） g，购自郑州大学实验动物研究中心。
1.2菌株副猪嗜血杆菌血清型4、5和12菌株，由河南科技大学微生物基因工程实验室保存。
1.3试剂与仪器 1.3.1试剂。胰蛋白大豆琼脂（Tryptic soy agar，TSA）和胰蛋白大豆肉汤（Tryptic soy broth，TSB），均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；新生牛血清，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD），购自瑞士Roche公司；CD3、CD19抗体及IgG、IgA、IgM和IgE ELISA检测试剂盒，均购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司。
1.3.2仪器。试验仪器有无菌操作台、超纯水仪、微量移液枪、数码水热恒温培养箱、恒温摇床、高压蒸汽灭菌锅、酶标仪、流甙细胞仪等。
1.4细菌复苏与培养将副猪嗜血杆菌血清型4、5和12菌株划线于含10%新生牛血清和20 μg/mL NAD的TSA平板培养过夜，然后将单菌落接种于含10%新生牛血清和20 μg/mL NAD的TSB液体培养基中，37 ℃下振荡培养24 h。
1.5动物感染与样本收集将72只小鼠随机分成4组：PBS对照组、血清型4组、血清型5组和血清型12组，分别腹腔接种PBS、副猪嗜血杆菌血清型4、5和12。于感染3、7和15 d后采用摘眼球法收集各组小鼠血液，将其分成2份：1份样品进行抗凝处理，用于T、B淋巴细胞检测分析；另1份收集血清，用于免疫球蛋白检测。
1.6T淋巴细胞检测样品中加入1.5 mL红细胞裂解液，室温孵育15 min后1 500 r/min离心5 min，PBS重悬。50 μL抗凝血与20 μL FITC-CD3抗体混匀后，避光孵育15 min。弃上清液后，用PBS清洗细胞1次，PBS重悬后上流式细胞仪分析。
1.7B淋巴细胞检测 使用全自动细胞计数仪检测全血总淋巴细胞数，同时使用流式细胞仪检测B淋巴细胞，在100 μL抗凝血中分别加入20 μL FITC-CD19、PE-CD3及同型阴性对照，避光孵育30 min，加入红细胞裂解液，室温孵育10 min，1 000 r/min离心5 min弃去上清，PBS重悬后上流式细胞仪分析。
1.8免疫球蛋白检测按照ELISA试剂盒说明书检测各组IgG、IgA、IgM和IgE水平。
1.9Th1/Th2比值检测按照ELISA试剂盒说明书检测各组小鼠血清IFN-γ和IL-10含量，以IFN-γ代表Th1，以IL-10代表Th2，计算Th1/Th2比值。
1.10数据统计与分析所有试验数据以平均值±标准差（±s）表示，使用SPSS 19.0统计软件对试验数据进行统计与分析，组间比较采用t检验，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
2结果与分析
2.1副猪嗜血杆菌感染不同时间点小鼠T、B淋巴细胞检测 由表1可知，感染3 d各感染组T、B淋巴细胞数量明显高于对照组（P<0.01）；感染7 d，各感染组T、B淋巴细胞数量有所下降，但均高于对照组（P<0.05）。感染15 d，各感染组T、B淋巴细胞数量极显著低于对照组（P<0.01）。不同血清型感染在不同时间点之间差异均无统计学意义。
2.2副猪嗜血杆菌感染不同时间点小鼠免疫球蛋白检测 由表2可知，各个时间点各感染组血清IgG与对照组相比均显著增高（P<0.01），且随着感染时间的延长，感染组IgG水平逐渐增高。感染组IgA、IgM和IgE水平与对照组相比具有一致性的变化趋势，即感染3 d各感染组IgA、IgM和IgE水平明显高于对照组（P<0.01），但其随着感染时间的延长呈逐渐下降趋势（P<0.01或P<0.05），其中15 d各感染组IgM和IgE水平降至正常水平（P<0.05）。各时间点血清型4和5感染组小鼠血清IgG均明显高于血清型12组（P<0.01）。
2.3副猪嗜血杆菌感染不同时间点小鼠Th1/Th2比值检测由表3可知，各组不同时间点IFN-γ和IL-10水平与对照组相比均明显升高（P<0.01）。感染3 d各感染组Th1/Th2比值稍有下降，但与对照组相比差异无统计学意义，而随着感染时间的延长，各感染组Th1/Th2比值逐渐升高，7 d和15 d各感染组Th1/Th2比值均明显高于对照组（P<0.05或P<0.01）。不同血清型感染在不同时间点之间IFN-γ和IL-10水平及Th1/Th2比值差异均无统计学意义。
3讨论与结论
淋巴细胞是机体主要免疫细胞，其数量变化可以反映机体的细胞免疫水平。CD3和CD19分别是T、B淋巴细胞表面的特异抗原，可以反映总T、B淋巴细胞的量[4]。该研究结果表明，副猪嗜血杆菌感染小鼠3 d T、B淋巴细胞数量明显增高，且随着感染时间的延长呈逐渐下降的趋势，但不同血清型感染各时间点之间均无明显差异。Ig是指B淋巴细胞或记忆细胞在外源物质刺激下增殖分化成的浆细胞所产生的一类蛋白质，主要分布在血清、组织液及外分泌液中。健康人血清中的Ig含量是恒定的，Ig在机体防御中发挥着重要作用。病原微生物感染机体后产生大量的Ig，以抵抗感染。该研究结果表明副猪嗜血杆菌感染小鼠后IgG水平随感染时间的延长而逐渐增高，而感染组IgA、IgM和IgE水平呈逐渐降低的趋势。但是，各时间点血清型4和5感染组小鼠血清IgG水平均明显高于血清型12组。这可能是因为副猪嗜血杆菌血清型12具有不同于血清型4和5的一些功能蛋白，所激发机体分泌产生抗体的水平不一致。
细胞因子是指一类由T细胞、B细胞、单核/巨噬细胞、NK细胞等免疫细胞和内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等某些非免疫细胞经外源物质刺激后合成、分泌的蛋白质或小分子多肽，这类小分子物质具有广泛生物学活性[5]。作为免疫系统中细胞间相互作用的信号分子，与细胞膜上受体结合后发挥多种生物效应，在调节免疫应答和炎症反应中起重要作用。根据在感染和炎症反应中的功能作用，又可将其分为促炎性细胞因子（IL-1、IL -8、TNF-α和IFN-γ等）和抑炎性细胞因子（IL-1rα、IL-4和IL-10等）2大类。该研究结果表明副猪嗜血杆菌感染小鼠血清IFN-γ和IL-10水平明显升高，但不同血清型之间差异无明显变化。正常情况下，机体Th1和Th2细胞功能均处于动态平衡状态，维持机体正常的细胞免疫和体液免疫功能。该研究结果表明感染3 d Th1/Th2比值稍有下降，而Th1/Th2比值随着感染时间的延长而逐渐升高，在7 d和15 d各感染组Th1/Th2比值均明显高于对照组，但不同血清型之间差异无明显变化。
安徽农业科学2016年参考文献
[1] MACEDO N，ROVIRA A，TORREMORELL M.Haemophilus parasuis：Infection，immunity and enrofloxacin [J].Vet Res，2015，46：128.
[2] KUEHN J S，REGISTER K B，PHILLIPS G J.Draft genome sequences for 10 isolates of the swine pathogen Haemophilus parasuis[J].Genome announc，2013，1（5）：739-752.
[3] KIELSTEIN P，RAPPGABRIELSON V J.Designation of 15 serovars of Haemophilus parasuis on the basis of immunodiffusion using heatstable antigen extracts [J].J Clin Microbiol，1992，30（4）：826-865.
[4] 张有聪，刘淑英.T淋巴细胞和B淋巴细胞的研究进展[J].畜牧与饲料科学（奶牛版），2006，1（6）：75-78.
[5] 高玲美，牛钟相，丁淑燕.动物细胞因子研究进展[J].动物医学进展，2003，24（4）：46-48.