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摘 要：为探究家禽养殖舍消毒前后细菌总数的变化情况。运用细菌培养计数方法，对某养殖公司肉鸭养殖场立体笼养鸭舍的14个检测点消毒前后总数进行了检测计数。结果表明： 鸭舍料槽、网床、水线、水碗、侧网处消毒前的菌落总数分别为14×104、1.6×104、10×104、8.3×104、3.0×104CFU/cm2。消毒后细菌总数分别为5.7×104、0.3×104、6.3×104、4.2×104、1.1×104CFU/cm2;10个检测点消毒前污染程度各不相同，消毒细菌数均有不同程度下降，消毒效果明显。
关键词：细菌检测;肉鸭养殖;消毒
中图分类号：S858.311.36 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2019）10-0044-04
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 隔水式电热恒温培养箱、立式压力蒸汽灭菌器、电热鼓风干燥箱、洁净工作台、营养琼脂培养基、氯化钠、麦康凯培养基、或微量移液器、吸耳球、试管、无菌培养皿、pH计或pH比色管或精密pH试纸、无菌棉拭子（棉签）等。
1.2 实验准备
1.2.1 培养基制备 配制溶液：称量好各种原料（营养琼脂等）和准备干净容器（锥形瓶等），依据培养基的配方，准备并称取各种原料，按序加入后使其溶解，最后补足所需水分，封口加热溶解（若在加热进程中水分蒸发，应在全部原料溶解后加水补足）。
调节pH值：用pH试纸测定培养基的pH值，若不符合需要可用10%稀盐酸或10%氢氧化钠进行调节，直到调节到中性（7.0～7.2）为止。
过滤：用滤纸趁热将已配好的培养基过滤。可将滤纸折叠（浸润）后，铺在漏斗上过滤。
分装制作平板培养基：在洁净工作台内，将剛刚灭过菌的盛有制备好营养琼脂培养液的锥形瓶和培养皿放在实验台上，待营养琼脂溶液冷却至60℃左右，点燃酒精灯，右手托起锥形瓶瓶底，将瓶口在酒精灯上稍微灼烧，左手在酒精灯火焰附近以无菌状态打开平皿盖，倾入琼脂溶液约15mL左右，轻轻摇晃，使培养基平铺于平皿底部，放置15min左右待其凝固后倒置过来，标注制作日期、名称等平放在隔水式电热恒温培养箱内备用。24h后查看，如培养基内长杂菌，弃用。
1.3 检测场所 山东省泰安市某养殖公司肉鸭养殖场立体笼养鸭舍。
1.3.1 鸭舍概况 本实验在泰安市某养殖公司的肉鸭养殖示范场采集样本，该养殖场于2014年10月建成投产，占地10000m2，建筑面积1200m2，建有钢架结构鸭舍、鸭粪阳光发酵处理池、消毒间等。养殖示范场设有三种不同养殖技术模式，分别是：网上平养，刮粪板机械清除;上网下床，采用农作物秸秆添加微生态制剂发酵床发酵鸭粪处理技术;立体笼养，采用自动化传送带清理鸭粪。该场消毒设施及消毒制度健全，消毒药物齐全，检测数据真实可靠且具有代表性。
1.3.2 消毒模式 空棚消毒[1]，进鸭苗前一天用改性戊二醛（50%）全棚喷洒消毒[2]。
2 样品采集与处理
2.1 样品采集
2.1.1 鸭舍消毒前样品的采集 采样时间：在立体笼养鸭舍清理鸭粪、灰尘、杂物等并用水彻底冲洗12h后，实验人员到鸭舍现场进行采集[3，4]。
采样点确定及采集方法：
空气中微生物检测：采用自然沉降的方法，分别在鸭舍第1、2排头处，第3、4排末尾和中间，第4、5排末尾各选择一个适宜位置，均匀分布，共4个采集点。距离地面高度约0.5m，避开风口，避免人员走动，分别放置营养琼脂培养基，打开平皿盖，暴露15min左右盖上平皿盖并注明栋舍号、采样日期、采样点号等备用。
养殖舍物体表面细菌的采集[5]：鸭舍的料槽、网床、水线、水碗、侧网处各确定2个采集区，每个采集区均匀分布一个采集点，共采集10个点，每个点采样面积1×5cm2，每个点采样10cm2。采样方法：点燃酒精灯，试管口灼烧灭菌再打开胶塞，每个采样点用灭菌生理盐水浸润灭菌棉拭子，迅速在采样点1×5cm2面积内横竖往返均匀涂擦，全部擦拭后，将棉拭子捻转去除手接触部位放入10ml灭菌生理盐水试管内，再换一采样点重复上述操作，两只棉拭子放入同一灭菌生理盐水试管，然后注明栋舍号、采样日期、采样点号等放入试管架上备用，即为该采样点采集的样本。
2.1.2 鸭舍消毒后样品的采集 鸭舍消毒后进鸭前1d，按2.1.1方法和要求进行采样。
2.2 待检样品处理 将空气中微生物检测和养殖舍物体表面细菌检测共14个采集点的样本放入同一个泡沫箱内，即为该鸭舍所采集样品，泡沫箱贴上标签，并注明栋舍号、采样区域、采样日期等，即为待测液体样品1：10稀释液（10倍液体样品），室温条件下保存，带回样品处理实验室备用。
2.2.1 待检液体样品的稀释 用1mL移液管吸取1mL待检液体样本置盛有9mL生理盐水的无菌试管中，充分混匀，制成1：100的待检样品稀释液[6]。再用1mL移液器吸取1：100待检样品稀释液1mL，沿管壁缓慢注入盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面以免使结果准确性下降），振摇试管或反复吹打使其均匀混合，制成1：1000的待检样品稀释液。按上述操作，制备10倍系列待检样品稀释液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管。依据对样品污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度的待检样品稀释液，根据鸭舍污染程度做了1：100、1：1000和1：10000三个稀释度。 2.2.2 细菌培养 在进行10倍递增稀释时，同时吸取1mL待检样品稀释液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平行试验。每个检测区域1：100、1：1000和1：10000三个稀释度分别做两个平行试验，同时吸取1mL灭菌生理盐水加入一个无菌平皿内作空白对照。共做35个培养平皿，包括34个检测，1个空白对照。34个检测包括：4个空气检测，30个养殖舍物体表面检测（每个采集点6个平皿，5个采样点，共30个）。及时将冷却至60℃的营养琼脂溶液培养基（可先放置于60℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注约15mL到平皿，并缓慢转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板倒置，放入隔水式电热恒温培养箱37±1℃培养24±2h[7，8]。
2.2.3 菌落计数 即计算55cm2平皿表面的菌落总数，可用肉眼直接观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录相应稀释倍数的菌落数量以防遗漏[7]。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。
2.2.4 菌落总数的计算与报告 菌落数小于100 CFU时，按“四舍五入”原則修约，以整数报告;菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替个位数;也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，取前2位数字;若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延;若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效（平面取样以CFU/cm2为报告单位，称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告）。
菌落总数测定根据《GB4789.2-2010菌落总数测定》进行相应处理，大肠杆菌测定根据《GB4789.38-2012大肠埃希菌计数》中所记录方法进行处理，金黄色葡萄球菌根据《GB4789.10-2010金黄色葡萄球菌检验》中所记录方法进行处理，霉菌根据《GB4789.15-2010霉菌和酵母计数》中所记录方法进行处理。
3 结果与分析
3.1 细菌总数检测结果 按上述方法，对某立体笼养鸭舍消毒前料槽、网床、水线、水碗、侧网等物体表面和空气沉降检测细菌总数的计算结果[9]，见表1和表2。
3.2 消毒效果检测结果 按上述方法，对某立体笼养鸭舍消毒后料槽、网床、水线、水碗、侧网等物体表面和空气沉降检测细菌总数的计算结果，见表3和表4。
4 讨论与结论
随着养禽业日新月异的发展使得细菌的检测方法在鉴定技术有新突破，不仅实现了对病原微生物进行准确鉴定，而且更适合于病原菌全面、快速、高质量检测的需要，为临床提供及时准确的细菌鉴定结果，在一定程度上有助于缓解传染病过度危害肉鸭的问题，减轻了养殖户和养殖公司的经济负担，促进行业的健康发展。
消毒前后检测结果对比显示，消毒后带菌量下降较为明显[10]，菌落数小于6.0×104CFU/cm2的物表所占比例达到75%，采样点中料槽是带菌量最大的物表，消毒前平均带菌量为14×104CFU/cm2，消毒后为5.7×104CFU/cm2，结果表明有效消毒后，能大量清除物表暂居菌的数量，消毒后的平均合格率达90%以上。
所以对禽舍消毒必须要高度重视，使用的消毒剂种类、使用剂量、消毒方法、消毒时间长短、禽舍内温湿度等不同均会产生不同的消毒效果。当平均合格率达到90%以上，即可证明禽舍的完成消毒且消毒合格，允许进行下一批次肉鸭的饲养;若平均合格率在90%以下，则说明此次消毒不合格，需要再次进行消毒，直至消毒合格后方可进行下一批次肉鸭的饲养。
参考文献：
[1] 齐胜利，孔庆友，何闪. 种鸭场空棚消毒的六大步骤[J].国外畜牧学-猪禽，2013，33（10）：42～44.
[2] 翟洪民.鸭舍消毒方法及注意事项[J].养禽与禽病防治，2014，5：40～41.
[3] 王光锋，李舫，靖吉强，等.种鸭场空舍期不同消毒模式的效果比较[J].中国家禽，2015，37（8）：64～68.
[4] 苏益琼.旱养肉鸭舍建设及消毒[J].畜牧兽医报，2015，7：1 .
[5] 吴水菊.病历夹细菌检测及消毒[J].临床护理杂志，2006，5（1）：53～54.
[6] 武世珍，靖吉强，王光峰，等.网养肉鸭舍不同消毒模式对金黄色葡萄球菌的消毒效果[J].黑龙江畜牧兽医，2016（8）：128～130.
[7] 李颖，李婷.影响乳酸菌平板菌落计数的方法研究[J].中国实用医药，2016，11，（16）：287～288.
[8] 王瑞莲，林裕龙.细菌检测方法研究进展[J].国际检验医学杂志，2014，35（16）：2200～2201.
[9] 沈小芳.办公室电脑键盘、鼠标表面消毒前后细菌污染状况[J].环境与职业医学，2010，27（3）：160～161.
[10] 杨竹兰，刘智勇，甘露，等.临床病区终末消毒前后物表暂居菌的比较研究[J].国际检验医学杂志，2015，36（11）：1491～1493.
[11] Branch-Elliman MD， Ernie RR. Direct feedback with the ATP luminometer as a process improvement tool for terminal cleaning of patient rooms[J]. Am J Infect Control.2014（42）：195～197.
[12] Xie P， Wang Y M， Wang C， et al. Effect of different fat sources in parental diets on growth performance， villus morphology， digestive enzymes and colorectal microbiota in pigeon squab[J]. Archives of Animal Nutrition，2015，67（2）：147～160.
[13] Bullman S，Luce B，Sleator R D.Molecular diagnostics the changing culture of medical microbiology[J]. Bioengineered， 2015，3（1）：1～7.
关键词：细菌检测;肉鸭养殖;消毒
中图分类号：S858.311.36 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2019）10-0044-04
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 隔水式电热恒温培养箱、立式压力蒸汽灭菌器、电热鼓风干燥箱、洁净工作台、营养琼脂培养基、氯化钠、麦康凯培养基、或微量移液器、吸耳球、试管、无菌培养皿、pH计或pH比色管或精密pH试纸、无菌棉拭子（棉签）等。
1.2 实验准备
1.2.1 培养基制备 配制溶液：称量好各种原料（营养琼脂等）和准备干净容器（锥形瓶等），依据培养基的配方，准备并称取各种原料，按序加入后使其溶解，最后补足所需水分，封口加热溶解（若在加热进程中水分蒸发，应在全部原料溶解后加水补足）。
调节pH值：用pH试纸测定培养基的pH值，若不符合需要可用10%稀盐酸或10%氢氧化钠进行调节，直到调节到中性（7.0～7.2）为止。
过滤：用滤纸趁热将已配好的培养基过滤。可将滤纸折叠（浸润）后，铺在漏斗上过滤。
分装制作平板培养基：在洁净工作台内，将剛刚灭过菌的盛有制备好营养琼脂培养液的锥形瓶和培养皿放在实验台上，待营养琼脂溶液冷却至60℃左右，点燃酒精灯，右手托起锥形瓶瓶底，将瓶口在酒精灯上稍微灼烧，左手在酒精灯火焰附近以无菌状态打开平皿盖，倾入琼脂溶液约15mL左右，轻轻摇晃，使培养基平铺于平皿底部，放置15min左右待其凝固后倒置过来，标注制作日期、名称等平放在隔水式电热恒温培养箱内备用。24h后查看，如培养基内长杂菌，弃用。
1.3 检测场所 山东省泰安市某养殖公司肉鸭养殖场立体笼养鸭舍。
1.3.1 鸭舍概况 本实验在泰安市某养殖公司的肉鸭养殖示范场采集样本，该养殖场于2014年10月建成投产，占地10000m2，建筑面积1200m2，建有钢架结构鸭舍、鸭粪阳光发酵处理池、消毒间等。养殖示范场设有三种不同养殖技术模式，分别是：网上平养，刮粪板机械清除;上网下床，采用农作物秸秆添加微生态制剂发酵床发酵鸭粪处理技术;立体笼养，采用自动化传送带清理鸭粪。该场消毒设施及消毒制度健全，消毒药物齐全，检测数据真实可靠且具有代表性。
1.3.2 消毒模式 空棚消毒[1]，进鸭苗前一天用改性戊二醛（50%）全棚喷洒消毒[2]。
2 样品采集与处理
2.1 样品采集
2.1.1 鸭舍消毒前样品的采集 采样时间：在立体笼养鸭舍清理鸭粪、灰尘、杂物等并用水彻底冲洗12h后，实验人员到鸭舍现场进行采集[3，4]。
采样点确定及采集方法：
空气中微生物检测：采用自然沉降的方法，分别在鸭舍第1、2排头处，第3、4排末尾和中间，第4、5排末尾各选择一个适宜位置，均匀分布，共4个采集点。距离地面高度约0.5m，避开风口，避免人员走动，分别放置营养琼脂培养基，打开平皿盖，暴露15min左右盖上平皿盖并注明栋舍号、采样日期、采样点号等备用。
养殖舍物体表面细菌的采集[5]：鸭舍的料槽、网床、水线、水碗、侧网处各确定2个采集区，每个采集区均匀分布一个采集点，共采集10个点，每个点采样面积1×5cm2，每个点采样10cm2。采样方法：点燃酒精灯，试管口灼烧灭菌再打开胶塞，每个采样点用灭菌生理盐水浸润灭菌棉拭子，迅速在采样点1×5cm2面积内横竖往返均匀涂擦，全部擦拭后，将棉拭子捻转去除手接触部位放入10ml灭菌生理盐水试管内，再换一采样点重复上述操作，两只棉拭子放入同一灭菌生理盐水试管，然后注明栋舍号、采样日期、采样点号等放入试管架上备用，即为该采样点采集的样本。
2.1.2 鸭舍消毒后样品的采集 鸭舍消毒后进鸭前1d，按2.1.1方法和要求进行采样。
2.2 待检样品处理 将空气中微生物检测和养殖舍物体表面细菌检测共14个采集点的样本放入同一个泡沫箱内，即为该鸭舍所采集样品，泡沫箱贴上标签，并注明栋舍号、采样区域、采样日期等，即为待测液体样品1：10稀释液（10倍液体样品），室温条件下保存，带回样品处理实验室备用。
2.2.1 待检液体样品的稀释 用1mL移液管吸取1mL待检液体样本置盛有9mL生理盐水的无菌试管中，充分混匀，制成1：100的待检样品稀释液[6]。再用1mL移液器吸取1：100待检样品稀释液1mL，沿管壁缓慢注入盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面以免使结果准确性下降），振摇试管或反复吹打使其均匀混合，制成1：1000的待检样品稀释液。按上述操作，制备10倍系列待检样品稀释液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管。依据对样品污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度的待检样品稀释液，根据鸭舍污染程度做了1：100、1：1000和1：10000三个稀释度。 2.2.2 细菌培养 在进行10倍递增稀释时，同时吸取1mL待检样品稀释液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平行试验。每个检测区域1：100、1：1000和1：10000三个稀释度分别做两个平行试验，同时吸取1mL灭菌生理盐水加入一个无菌平皿内作空白对照。共做35个培养平皿，包括34个检测，1个空白对照。34个检测包括：4个空气检测，30个养殖舍物体表面检测（每个采集点6个平皿，5个采样点，共30个）。及时将冷却至60℃的营养琼脂溶液培养基（可先放置于60℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注约15mL到平皿，并缓慢转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板倒置，放入隔水式电热恒温培养箱37±1℃培养24±2h[7，8]。
2.2.3 菌落计数 即计算55cm2平皿表面的菌落总数，可用肉眼直接观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录相应稀释倍数的菌落数量以防遗漏[7]。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。
2.2.4 菌落总数的计算与报告 菌落数小于100 CFU时，按“四舍五入”原則修约，以整数报告;菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替个位数;也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，取前2位数字;若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延;若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效（平面取样以CFU/cm2为报告单位，称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告）。
菌落总数测定根据《GB4789.2-2010菌落总数测定》进行相应处理，大肠杆菌测定根据《GB4789.38-2012大肠埃希菌计数》中所记录方法进行处理，金黄色葡萄球菌根据《GB4789.10-2010金黄色葡萄球菌检验》中所记录方法进行处理，霉菌根据《GB4789.15-2010霉菌和酵母计数》中所记录方法进行处理。
3 结果与分析
3.1 细菌总数检测结果 按上述方法，对某立体笼养鸭舍消毒前料槽、网床、水线、水碗、侧网等物体表面和空气沉降检测细菌总数的计算结果[9]，见表1和表2。
3.2 消毒效果检测结果 按上述方法，对某立体笼养鸭舍消毒后料槽、网床、水线、水碗、侧网等物体表面和空气沉降检测细菌总数的计算结果，见表3和表4。
4 讨论与结论
随着养禽业日新月异的发展使得细菌的检测方法在鉴定技术有新突破，不仅实现了对病原微生物进行准确鉴定，而且更适合于病原菌全面、快速、高质量检测的需要，为临床提供及时准确的细菌鉴定结果，在一定程度上有助于缓解传染病过度危害肉鸭的问题，减轻了养殖户和养殖公司的经济负担，促进行业的健康发展。
消毒前后检测结果对比显示，消毒后带菌量下降较为明显[10]，菌落数小于6.0×104CFU/cm2的物表所占比例达到75%，采样点中料槽是带菌量最大的物表，消毒前平均带菌量为14×104CFU/cm2，消毒后为5.7×104CFU/cm2，结果表明有效消毒后，能大量清除物表暂居菌的数量，消毒后的平均合格率达90%以上。
所以对禽舍消毒必须要高度重视，使用的消毒剂种类、使用剂量、消毒方法、消毒时间长短、禽舍内温湿度等不同均会产生不同的消毒效果。当平均合格率达到90%以上，即可证明禽舍的完成消毒且消毒合格，允许进行下一批次肉鸭的饲养;若平均合格率在90%以下，则说明此次消毒不合格，需要再次进行消毒，直至消毒合格后方可进行下一批次肉鸭的饲养。
参考文献：
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[3] 王光锋，李舫，靖吉强，等.种鸭场空舍期不同消毒模式的效果比较[J].中国家禽，2015，37（8）：64～68.
[4] 苏益琼.旱养肉鸭舍建设及消毒[J].畜牧兽医报，2015，7：1 .
[5] 吴水菊.病历夹细菌检测及消毒[J].临床护理杂志，2006，5（1）：53～54.
[6] 武世珍，靖吉强，王光峰，等.网养肉鸭舍不同消毒模式对金黄色葡萄球菌的消毒效果[J].黑龙江畜牧兽医，2016（8）：128～130.
[7] 李颖，李婷.影响乳酸菌平板菌落计数的方法研究[J].中国实用医药，2016，11，（16）：287～288.
[8] 王瑞莲，林裕龙.细菌检测方法研究进展[J].国际检验医学杂志，2014，35（16）：2200～2201.
[9] 沈小芳.办公室电脑键盘、鼠标表面消毒前后细菌污染状况[J].环境与职业医学，2010，27（3）：160～161.
[10] 杨竹兰，刘智勇，甘露，等.临床病区终末消毒前后物表暂居菌的比较研究[J].国际检验医学杂志，2015，36（11）：1491～1493.
[11] Branch-Elliman MD， Ernie RR. Direct feedback with the ATP luminometer as a process improvement tool for terminal cleaning of patient rooms[J]. Am J Infect Control.2014（42）：195～197.
[12] Xie P， Wang Y M， Wang C， et al. Effect of different fat sources in parental diets on growth performance， villus morphology， digestive enzymes and colorectal microbiota in pigeon squab[J]. Archives of Animal Nutrition，2015，67（2）：147～160.
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