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摘要:本文旨在建立一种制备19-去甲睾酮完全抗原及单克隆抗体的方法。通过丁二酸酐将19-去甲睾酮(19 β NT)半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到偶联物(19 β NT-HAS-BSA),以此进行免疫、筛选,最终获得3株阳性杂交瘤细胞(4D5,6F2,7E7),并制得相应的单克隆抗体。用间接竞争酶联免疫法,对7E7株抗体进行鉴定,发现:抗体的亲和常数为3.35×108 L/mol,半抑制浓度为0.35 ng/mL,表明此抗体对19-去甲睾酮有很强的亲和力;以19-去甲睾酮为参照物,抗体对丙酸诺龙的交叉反应率为80.3%,对甲基睾酮、睾酮、群勃龙、己烯雌酚等的交叉反应率均小于0.2%,表明此抗体具有良好的特异性。由此可知,7E7株抗体可用于对19-去甲睾酮、丙酸诺龙的免疫分析。
关键词:19-去甲睾酮 单克隆抗体 间接竞争酶联免疫法 交叉反应率
中图分类号:R446 文献标识码:A 文章编号:1672-5336(2015)08-0000-00
19-去甲睾酮(19-nortestosterone,NT),简称诺龙,分子量为274.4,是一种合成激素,具有雄激素样作用的同化激素,有很强的促蛋白合成能力,参与生长发育的生理调节,促进骨骼和肌肉的生长,被非法用于动物饲料添加剂。本文采用与免疫原不同偶联臂的筛选原筛选抗19-去甲睾酮单克隆杂交瘤细胞株,制备高亲和力抗19-去甲睾酮单克隆抗体,为研制高灵敏度的检测19-去甲睾酮免疫方法提供基础。
1材料与方法
1.1主要试剂
19-去甲睾酮、甲基睾酮、睾酮、丙酸诺龙、群勃龙、己烯雌酚、盐酸克仑特罗、沙丁胺醇,德国Dr公司;牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、BCA法蛋白质浓度测定试剂盒,生工生物工程;弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、PEG1500,sigma;RPMI-1640培养基、HAT选择培养基,Gibco;SP2/0公司保种;胎牛血清(FBS),杭州四季青生物工程公司;羊抗鼠酶标二抗(GaMIgG-HRP)、过氧化脲、TMB、降脂烷,sigma产品,其它试剂均为分析纯。
1.2主要设备
SW-CJ-2FD净化工作台,苏州净化设备有限公司;HF151UV CO2培养箱,Heal Force;TS100电子显微镜,Nikon;TDL-40B 上海安亭科学仪器厂;立式压力蒸汽灭菌器,BOXUN;BSA224S-CW电子天平,Sartorius;酶标仪MULTISKAN MK3,Thermo;明澈TM-D24UV纯水系统,Millipore;精密酸度计ORION 3 STAR,Thermo;分光光度计(北京普析)。
1.3实验动物
6~8周龄Balb/C雌性小鼠,广东省医学实验动物中心。
1.4方法
1.4.1完全抗原制备
(1)免疫原制备。采用丁二酸酐,EDC法合成免疫原,用TLC点板跟踪。
(2)筛选原制备。采用戊二酸酐,EDC法合成筛选原,用TLC点板跟踪。
1.4.2蛋白含量的测定
按照BCA法蛋白质浓度测定试剂盒使用说明书,对蛋白进行蛋白浓度测定。
1.4.3动物免疫
6~8周龄Balb/C雌性小鼠,取一定量的抗原与等量的弗氏佐剂乳化,25ug/只,分多点皮下注射。第一次用弗氏完全佐剂,以后用不完全佐剂,共免疫5次,融合前三天不加佐剂20ug/只,腹腔注射。
1.4.4抗血清效价及抑制率的测定
(1)酶标板准备。用碳酸缓冲液(PH9.6)将筛选原稀释成0.1ug/ml,100ul/孔,4度过夜;第二天用3%脱脂奶粉120ul/孔封闭,37度,60分钟孵育,洗板4次。
(2)抗血清效价测定。用PBST将血清稀释不同的倍数,每孔加入50ulPBS,加入50ul稀释好的抗血清,37度,30分钟孵育,洗板4次;加入稀释好的酶标二抗100ul/孔;37度,30分钟孵育,洗板4次;加入显色剂100ul/孔,37度15分钟孵育;加入终止液50ul/孔;在酶标仪450nm处读数。
(3)血清抑制率测定。每孔加入50ul,用PBS稀释成不同浓度的NT,加入50ul稀释好的抗血清,37度,30分钟孵育,洗板4次;加入稀释好的酶标二抗100ul/孔;37度,30分钟孵育,洗板4次;加入显色剂100ul/孔,37度15分钟孵育;加入终止液50ul/孔;在酶标仪450nm处读数。
1.4.5细胞融合
融合半个月前复苏SP2/0细胞,用1×8-氮杂鸟嘌呤培养。融合前3天对小鼠进行冲击免疫,融合前1天做饲养细胞用HAT培养。融合时,脱颈致死小鼠,无菌取脾制备脾细胞在PEG-1500作用下与SP2/0细胞进行融合(细胞数量比约为5:1),融合后的细胞悬液加入到一铺有饲养细胞的96孔细胞板中,HAT培养。
1.4.6杂交瘤细胞筛选
融合后12天进行换全液,14~15天用间接ELISA和间接竞争ELISA(icELISA)筛选强阳性、抑制率高、生长状态好的杂交瘤细胞株,并进行3次亚克隆。将筛选的杂交瘤细胞株由96孔板转到24孔板,再到125ml的细胞瓶中扩大培养。待细胞数量足够多时,收集细胞,用含10%DMSO的培养基在液氮中保存(冻存过程为4度放置30分钟,-20度放置30分钟,干冰中过夜,然后转到液氮罐中)。
1.4.7单克隆抗体的生产
杂交瘤细胞扩大生长后收集细胞,将细胞浓度调整到2×106个/ml,然后向10天前注射过降脂烷的小鼠腹腔注射0.5ml/只。待小鼠腹部明显胀大,精神状态不佳时,抽取腹水,饱和硫酸铵法纯化19-去甲睾酮单克隆抗体。. 1.4.8单克隆抗体免疫性质鉴定
(1)BCA法蛋白质浓度测定试剂盒测定单克隆抗体蛋白含量;方阵滴定法确定最佳包被抗原浓度和单克隆抗体稀释度;间接竞争ELISA测定灵敏度;交叉反应率CR测定特异性。CR=(NT的IC50/类似物或常见药物的I50)×100,R越低、抗体特异性越强。
(2)单抗对19-去甲睾酮的亲和常数试验:以1μg/mL NT-OVA包被,间接ELISA法测定不同浓度的抗NT单克隆抗体与包被抗原反应的A450nm值,以单克隆抗体浓度为横坐标,以A450nm值为纵坐标绘制反应曲线,并在曲线上找到趋于平坦段A值的50%所对应的单克隆抗体浓度,以其倒数作为亲和常数Ka。
2结果
2.1人工完全抗原的鉴定
19-去甲睾酮分子量为274.4,属小分子化合物,只有反应原性,没有免疫原性,必须与大分子载体蛋白偶联才能刺激动物产生相应抗体。本试验采用丁二酸酐,EDC法与BSA偶联形成免疫抗原;采用戊二酸酐,EDC法与OVA偶联形成包被原。为证明免疫抗原与包被抗原偶联反应是否成功,本试验用以下方法对人工完全抗原进行鉴定。
2.1.1紫外扫描
具有共轭系统的物质,由于分子组成与空间构型不同,具有特征性的紫外光谱,因此可以通过紫外光谱定性鉴定抗原是否偶联成功。根据扫描结果可知偶联物的吸收峰发生明显偏移,表明小分子与载体蛋白成功偶联。
2.1.2完全抗原蛋白浓度的测定
利用BCA试剂盒测定人工抗原的蛋白质含量。按照标准蛋白形成的标准曲线计算得到免疫原NT-BSA蛋白质的浓度是8.29mg/mL,包被抗原NT-OVA中蛋白质的浓度是10.9mg/mL。
2.2动物免疫血清检测
2.2.1 动物免疫血清效价检测
以HRP为二抗,TMB为显色体系,采用间接ELISA法测定四只小鼠的血清效价。从图1可以看出,4只小鼠血清效价都达到了320000左右。
2.2.2 免疫血清抑制率测定
将系列浓度的19-去甲睾酮标准溶液与4只小鼠血清进行间接ELISA试验,以NT浓度对数为横坐标,以B/B0×100%为纵坐标。结果见图2。从图2可以看出1号小鼠标准曲线y=24.90-46.99x,R2=0.985,IC50=0.292μg/mL;2号小鼠标准曲线y=33.16-55.19x,R2=0.997,IC50=0.495μg/mL;3号小鼠标准曲线y=32.87-47.96x,R2=0.919,IC50=0.439μg/mL;4号小鼠标准曲线y=31.29-45.69x,R2=0.998,IC50=0.389μg/mL。1号小鼠IC50明显小于其他3个小鼠,故将其进行细胞融合。
2.3细胞融合筛选
细胞融合后两周,用间接ELISA法检测8块96孔细胞培养板中的上清,共获得10个阳性孔,由于这10个阳性孔中有4个孔细胞生长状态不好,去除这4个孔,最终得到6个阳性孔,将这6株细胞进行多次亚克隆,最后用间接ELISA法测定单克隆细胞培养上清的亲和性,其中有3个单克隆孔的上清效价高,亲和性好,分别命名为4D5,6F2,7E7。综合比较间接ELISA的结果及细胞生长状态,最后选择7E7编号的细胞株进行细胞扩大,制备腹水,其余的冻存备份。
2.4单克隆抗体免疫性质鉴定
2.4.1 单克隆抗体蛋白浓度测定
经过包和硫酸铵法纯化的单克隆抗体,利用BCA试剂盒测定人工抗原的蛋白质含量。按照标准蛋白形成的标准曲线计算得到单克隆抗体蛋白浓度为5.45mg/mL。
2.4.2 标准曲线建立抗19-去甲睾酮单克隆抗体间接竞争标准曲线的建立
通过方阵滴定法确定最佳包被抗原浓度和单克隆抗体稀释度,用0.01mol,PH=7.4的PBS稀释19-去甲睾酮,建立了抗19-去甲睾酮单克隆抗体间接竞争标准曲线,半抑制浓度(IC50)为0.35ng/mL。
2.4.3单抗对19-去甲睾酮的亲和能力测定
以1μg/mL NT-OVA包被,idELISA法测定单克隆抗体的亲和力,取趋于平坦段A450nm值为2.22的50%所对应的单克隆抗体浓度,以其倒数作为亲和常数(Ka),所获单克隆抗体的Ka为3.35×108L/mol。
2.4.4特异性试验
选择结构相似的药物以及己烯雌酚、盐酸克仑特罗、沙丁胺醇分别与NT单克隆抗体对结构类似物的交叉反应率。对丙酸诺龙交叉反应率达80.25%,对甲基睾酮、睾酮、群勃龙、己烯雌酚、盐酸克仑特罗、沙丁胺醇均小于0.2%,显示良好的特异性。
3 分析与讨论
半抗原,抗原与抗体之间是通过氢键、疏水基团,静电作用等共同决定的。不同长度的碳链能够避开桥抗干扰作用,改变包被原与检测物直接的竞争性平衡关系,从而提高抗体检测的灵敏度和减少类似物的交叉反应率。本实验利用丁二酸酐作为免疫原的连接臂,通过多次小剂量免疫小鼠与及采用比免疫原长一个碳链的戊二酸酐作为包被抗原的连接臂,检测灵敏度达到0.35ng/ml,实现了提高灵敏度的目的,具有较高的应用价值。
收稿日期:2015-03-10
作者简介:谢冬霞(1982—),女,汉族,广东梅州人,本科,总经理,中级职称,研究方向:食品安全检测技术。
关键词:19-去甲睾酮 单克隆抗体 间接竞争酶联免疫法 交叉反应率
中图分类号:R446 文献标识码:A 文章编号:1672-5336(2015)08-0000-00
19-去甲睾酮(19-nortestosterone,NT),简称诺龙,分子量为274.4,是一种合成激素,具有雄激素样作用的同化激素,有很强的促蛋白合成能力,参与生长发育的生理调节,促进骨骼和肌肉的生长,被非法用于动物饲料添加剂。本文采用与免疫原不同偶联臂的筛选原筛选抗19-去甲睾酮单克隆杂交瘤细胞株,制备高亲和力抗19-去甲睾酮单克隆抗体,为研制高灵敏度的检测19-去甲睾酮免疫方法提供基础。
1材料与方法
1.1主要试剂
19-去甲睾酮、甲基睾酮、睾酮、丙酸诺龙、群勃龙、己烯雌酚、盐酸克仑特罗、沙丁胺醇,德国Dr公司;牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、BCA法蛋白质浓度测定试剂盒,生工生物工程;弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、PEG1500,sigma;RPMI-1640培养基、HAT选择培养基,Gibco;SP2/0公司保种;胎牛血清(FBS),杭州四季青生物工程公司;羊抗鼠酶标二抗(GaMIgG-HRP)、过氧化脲、TMB、降脂烷,sigma产品,其它试剂均为分析纯。
1.2主要设备
SW-CJ-2FD净化工作台,苏州净化设备有限公司;HF151UV CO2培养箱,Heal Force;TS100电子显微镜,Nikon;TDL-40B 上海安亭科学仪器厂;立式压力蒸汽灭菌器,BOXUN;BSA224S-CW电子天平,Sartorius;酶标仪MULTISKAN MK3,Thermo;明澈TM-D24UV纯水系统,Millipore;精密酸度计ORION 3 STAR,Thermo;分光光度计(北京普析)。
1.3实验动物
6~8周龄Balb/C雌性小鼠,广东省医学实验动物中心。
1.4方法
1.4.1完全抗原制备
(1)免疫原制备。采用丁二酸酐,EDC法合成免疫原,用TLC点板跟踪。
(2)筛选原制备。采用戊二酸酐,EDC法合成筛选原,用TLC点板跟踪。
1.4.2蛋白含量的测定
按照BCA法蛋白质浓度测定试剂盒使用说明书,对蛋白进行蛋白浓度测定。
1.4.3动物免疫
6~8周龄Balb/C雌性小鼠,取一定量的抗原与等量的弗氏佐剂乳化,25ug/只,分多点皮下注射。第一次用弗氏完全佐剂,以后用不完全佐剂,共免疫5次,融合前三天不加佐剂20ug/只,腹腔注射。
1.4.4抗血清效价及抑制率的测定
(1)酶标板准备。用碳酸缓冲液(PH9.6)将筛选原稀释成0.1ug/ml,100ul/孔,4度过夜;第二天用3%脱脂奶粉120ul/孔封闭,37度,60分钟孵育,洗板4次。
(2)抗血清效价测定。用PBST将血清稀释不同的倍数,每孔加入50ulPBS,加入50ul稀释好的抗血清,37度,30分钟孵育,洗板4次;加入稀释好的酶标二抗100ul/孔;37度,30分钟孵育,洗板4次;加入显色剂100ul/孔,37度15分钟孵育;加入终止液50ul/孔;在酶标仪450nm处读数。
(3)血清抑制率测定。每孔加入50ul,用PBS稀释成不同浓度的NT,加入50ul稀释好的抗血清,37度,30分钟孵育,洗板4次;加入稀释好的酶标二抗100ul/孔;37度,30分钟孵育,洗板4次;加入显色剂100ul/孔,37度15分钟孵育;加入终止液50ul/孔;在酶标仪450nm处读数。
1.4.5细胞融合
融合半个月前复苏SP2/0细胞,用1×8-氮杂鸟嘌呤培养。融合前3天对小鼠进行冲击免疫,融合前1天做饲养细胞用HAT培养。融合时,脱颈致死小鼠,无菌取脾制备脾细胞在PEG-1500作用下与SP2/0细胞进行融合(细胞数量比约为5:1),融合后的细胞悬液加入到一铺有饲养细胞的96孔细胞板中,HAT培养。
1.4.6杂交瘤细胞筛选
融合后12天进行换全液,14~15天用间接ELISA和间接竞争ELISA(icELISA)筛选强阳性、抑制率高、生长状态好的杂交瘤细胞株,并进行3次亚克隆。将筛选的杂交瘤细胞株由96孔板转到24孔板,再到125ml的细胞瓶中扩大培养。待细胞数量足够多时,收集细胞,用含10%DMSO的培养基在液氮中保存(冻存过程为4度放置30分钟,-20度放置30分钟,干冰中过夜,然后转到液氮罐中)。
1.4.7单克隆抗体的生产
杂交瘤细胞扩大生长后收集细胞,将细胞浓度调整到2×106个/ml,然后向10天前注射过降脂烷的小鼠腹腔注射0.5ml/只。待小鼠腹部明显胀大,精神状态不佳时,抽取腹水,饱和硫酸铵法纯化19-去甲睾酮单克隆抗体。. 1.4.8单克隆抗体免疫性质鉴定
(1)BCA法蛋白质浓度测定试剂盒测定单克隆抗体蛋白含量;方阵滴定法确定最佳包被抗原浓度和单克隆抗体稀释度;间接竞争ELISA测定灵敏度;交叉反应率CR测定特异性。CR=(NT的IC50/类似物或常见药物的I50)×100,R越低、抗体特异性越强。
(2)单抗对19-去甲睾酮的亲和常数试验:以1μg/mL NT-OVA包被,间接ELISA法测定不同浓度的抗NT单克隆抗体与包被抗原反应的A450nm值,以单克隆抗体浓度为横坐标,以A450nm值为纵坐标绘制反应曲线,并在曲线上找到趋于平坦段A值的50%所对应的单克隆抗体浓度,以其倒数作为亲和常数Ka。
2结果
2.1人工完全抗原的鉴定
19-去甲睾酮分子量为274.4,属小分子化合物,只有反应原性,没有免疫原性,必须与大分子载体蛋白偶联才能刺激动物产生相应抗体。本试验采用丁二酸酐,EDC法与BSA偶联形成免疫抗原;采用戊二酸酐,EDC法与OVA偶联形成包被原。为证明免疫抗原与包被抗原偶联反应是否成功,本试验用以下方法对人工完全抗原进行鉴定。
2.1.1紫外扫描
具有共轭系统的物质,由于分子组成与空间构型不同,具有特征性的紫外光谱,因此可以通过紫外光谱定性鉴定抗原是否偶联成功。根据扫描结果可知偶联物的吸收峰发生明显偏移,表明小分子与载体蛋白成功偶联。
2.1.2完全抗原蛋白浓度的测定
利用BCA试剂盒测定人工抗原的蛋白质含量。按照标准蛋白形成的标准曲线计算得到免疫原NT-BSA蛋白质的浓度是8.29mg/mL,包被抗原NT-OVA中蛋白质的浓度是10.9mg/mL。
2.2动物免疫血清检测
2.2.1 动物免疫血清效价检测
以HRP为二抗,TMB为显色体系,采用间接ELISA法测定四只小鼠的血清效价。从图1可以看出,4只小鼠血清效价都达到了320000左右。
2.2.2 免疫血清抑制率测定
将系列浓度的19-去甲睾酮标准溶液与4只小鼠血清进行间接ELISA试验,以NT浓度对数为横坐标,以B/B0×100%为纵坐标。结果见图2。从图2可以看出1号小鼠标准曲线y=24.90-46.99x,R2=0.985,IC50=0.292μg/mL;2号小鼠标准曲线y=33.16-55.19x,R2=0.997,IC50=0.495μg/mL;3号小鼠标准曲线y=32.87-47.96x,R2=0.919,IC50=0.439μg/mL;4号小鼠标准曲线y=31.29-45.69x,R2=0.998,IC50=0.389μg/mL。1号小鼠IC50明显小于其他3个小鼠,故将其进行细胞融合。
2.3细胞融合筛选
细胞融合后两周,用间接ELISA法检测8块96孔细胞培养板中的上清,共获得10个阳性孔,由于这10个阳性孔中有4个孔细胞生长状态不好,去除这4个孔,最终得到6个阳性孔,将这6株细胞进行多次亚克隆,最后用间接ELISA法测定单克隆细胞培养上清的亲和性,其中有3个单克隆孔的上清效价高,亲和性好,分别命名为4D5,6F2,7E7。综合比较间接ELISA的结果及细胞生长状态,最后选择7E7编号的细胞株进行细胞扩大,制备腹水,其余的冻存备份。
2.4单克隆抗体免疫性质鉴定
2.4.1 单克隆抗体蛋白浓度测定
经过包和硫酸铵法纯化的单克隆抗体,利用BCA试剂盒测定人工抗原的蛋白质含量。按照标准蛋白形成的标准曲线计算得到单克隆抗体蛋白浓度为5.45mg/mL。
2.4.2 标准曲线建立抗19-去甲睾酮单克隆抗体间接竞争标准曲线的建立
通过方阵滴定法确定最佳包被抗原浓度和单克隆抗体稀释度,用0.01mol,PH=7.4的PBS稀释19-去甲睾酮,建立了抗19-去甲睾酮单克隆抗体间接竞争标准曲线,半抑制浓度(IC50)为0.35ng/mL。
2.4.3单抗对19-去甲睾酮的亲和能力测定
以1μg/mL NT-OVA包被,idELISA法测定单克隆抗体的亲和力,取趋于平坦段A450nm值为2.22的50%所对应的单克隆抗体浓度,以其倒数作为亲和常数(Ka),所获单克隆抗体的Ka为3.35×108L/mol。
2.4.4特异性试验
选择结构相似的药物以及己烯雌酚、盐酸克仑特罗、沙丁胺醇分别与NT单克隆抗体对结构类似物的交叉反应率。对丙酸诺龙交叉反应率达80.25%,对甲基睾酮、睾酮、群勃龙、己烯雌酚、盐酸克仑特罗、沙丁胺醇均小于0.2%,显示良好的特异性。
3 分析与讨论
半抗原,抗原与抗体之间是通过氢键、疏水基团,静电作用等共同决定的。不同长度的碳链能够避开桥抗干扰作用,改变包被原与检测物直接的竞争性平衡关系,从而提高抗体检测的灵敏度和减少类似物的交叉反应率。本实验利用丁二酸酐作为免疫原的连接臂,通过多次小剂量免疫小鼠与及采用比免疫原长一个碳链的戊二酸酐作为包被抗原的连接臂,检测灵敏度达到0.35ng/ml,实现了提高灵敏度的目的,具有较高的应用价值。
收稿日期:2015-03-10
作者简介:谢冬霞(1982—),女,汉族,广东梅州人,本科,总经理,中级职称,研究方向:食品安全检测技术。