【摘 要】
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目的构建过表达生长分化因子5(GDF5)与基因沉默锌离子转运蛋白(ZIP8)的双重功能慢病毒载体,检测其在诱导多能干细胞中的表达效率并建立稳定细胞系,为骨关节炎的细胞治疗提供
【机 构】
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川北医学院第二临床医学院·,南充市中心医院组织工程与干细胞研究所
【基金项目】
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国家自然科学基金(81201407);四川省科技厅应用基础项目(2016JY0123);四川省教育厅自然科学重点项目(16ZA0235,17ZA0178);南充市科技局基础研究项目(16YFZJ0031);川北医学院科研发展计划(CBY15-A-ZD01,CBY15-A-ZD06)
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目的构建过表达生长分化因子5(GDF5)与基因沉默锌离子转运蛋白(ZIP8)的双重功能慢病毒载体,检测其在诱导多能干细胞中的表达效率并建立稳定细胞系,为骨关节炎的细胞治疗提供种子细胞奠定相关研究基础。方法以人的GDF5cDNA为模板合成GDF5全长序列,设计合成靶向小鼠ZIP8的shRNA序列,依次分别与双酶切的载体pRNAU6.2相连,构建双重功能慢病毒载体。将重组质粒及阴性对照质粒分别与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,收集病毒上清后感染iPSCs细胞,实时定量PCR和免疫印迹分别检测GDF5蛋白和ZIP8mRNA的过表达与沉默效果。经G418筛选获得稳定高效表达GDF5与基因沉默ZIP8的诱导多能干细胞(iPSCs)稳定细胞株。结果成功构建了双重功能慢病毒载体pRNAU6.2-CMV-hGDF5-mshZIP8-U6,经感染和G418筛选获得稳定表达高效表达GDF5与基因沉默ZIP8的iPSCs稳定细胞株。结论成功构建的pRNAU6.2-hGDF5-mshZIP8-U6慢病毒载体,可有效上调GDF5与下调ZIP8的蛋白和mRNA的表达,成功建立稳定高效表达GDF5与基因沉默ZIP8的iPSCs细胞株,为骨关节炎的细胞治疗建立可靠的细胞平台。
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