【摘 要】
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目的构建携带大鼠血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)基因的重组腺病毒表达载体并确定其对INS-1细胞的感染效率。方法采用RT-PCR方法,从大鼠肾脏组织
【机 构】
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首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科
【基金项目】
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国家自然科学基金（30671001）资助项目
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目的构建携带大鼠血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)基因的重组腺病毒表达载体并确定其对INS-1细胞的感染效率。方法采用RT-PCR方法,从大鼠肾脏组织中扩增出ACE2基因的全长cDNA序列,将ACE2基因定向克隆到穿梭质粒载体pShuttle-GFP-CMV,经与腺病毒骨架质粒pAdxsi载体同源重组后得到携带大鼠ACE2基因的重组腺病毒(pAdxsi-GFP-CMV-ACE2),采用PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定,转染HEK293细胞进行包装和扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化,半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose,TCID50)方法测定重组腺病毒的滴度。体外转染INS-1细胞,绿色荧光观察绿色荧光蛋白(GFP)和Western blotting检测ACE2蛋白的表达。结果克隆得到大鼠ACE2基因,经PCR鉴定和测序证实结果正确,成功构建得到高滴度的重组腺病毒,并能高效感染INS-1细胞。结论成功构建了表达ACE2的复制缺陷型重组腺病毒,为深入研究ACE2基因在胰岛细胞中的生物学功能提供了一定的工作基础。
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