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这两年在讲授人教版选修3《现代生物科技专题》的“基因工程”专题部分时，发现无论是部分老师，还是学生对其中的有关问题，都存在着或多或少的疑问，现收集教学一线碰到的以下问题逐一进行解析，供同行参考。
问题1：在现代生物技术应用中，利用最多的就是在细菌细胞中生产真核蛋白，比如人胰岛素和生长激素。但是，真核基因的核基因序列却很少直接用来做表达蛋白质的工作，这是为什么?
第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。
第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。
第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。
问题3：为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA?
解析：迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵，达到保护自身的目的。
问题4：为什么在分子克隆实验中使用最普遍的是那些识别4个或6个碱基对的限制性内切酶?
解析：限制性内切酶的识别位点可以是4个、5个、6个、8个甚至更多的碱基对(表1)。由于限制性内切酶的识别位点在DNA分子中出现的频率不同，即识别位点序列短的限制性内切酶就会更频繁地切割DNA分子，因此，在分子克隆实验中使用最普遍的是那些识别4个或6个碱基对的限制性内切酶。
问题5：如何构建基因文库?
解析：在原核生物中，结构基因通常会在基因组DNA上形成一个连续的编码区域，但在真核细胞中，外显子往往会被内含子分开。因此在处理原核基因和真核基因的分离时，要分别采取不同的克隆步骤。
在原核细胞中，目的DNA通常在总的染色体DNA中的含量非常少(小于0.02％)。要克隆原核基因，首先要用限制性内切酶对总DNA酶解，然后把这些酶解的DNA片段克隆转进载体，再对带有外源DNA片段的重组克隆进行鉴定、分离、再培养和进一步鉴定。整个过程称为基因文库的构建。从定义上讲，一个完整的基因文库应该包括目的生物体所有的基因组DNA。
构建基因文库大多采用一种识别4个碱基序列的限制性内切酶(如Sau3A I)进行酶解，理论上讲它应该是每256个碱基就切一次，调整酶解反应的条件可以使它部分酶解基因组DNA，产生出所有的可能大小的片段(图4)。由于限制性内切酶的位点在基因组DNA上并不是随机排列的，有些片段可能会太大而无法克隆，这时文库就不完整，要找到某一个特异的目的DNA片段也许就要难一些。
问题6：目的基因为何必须和运载体结合形成重组DNA才导人受体细胞?
解析：基因表达载体构建的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。要想使新的重组DNA分子在宿主细胞中保存下去，就要求这两个不同来源的DNA分子中至少有一个分子必须提供其在细胞中保存下来所需的生物学功能，这个分子就是基因工程中常用的载体。
问题7：运输基因的载体上为何常带有一个或多个标记基因?
解析：运载体上的特殊的遗传标记基因，可供重组DNA的鉴定与选择。这里以外源DNA插入到pBR322的Barn HI位点中为例来加以说明：图5是pBR322质粒结构示意图：pBR322质粒含有两个抗生素抗性基因(抗氨苄青霉素和抗四环素)；还有单一的Barn Hl、HindⅢ和Sal I的识别位点，这3个位点都在四环素抗性基因内；另一个单一的Pst I识别位点在氨苄青霉素抗性基因内。pBR322带有一个复制起始位点，它可以保证这个质粒只在大肠杆菌里行使复制功能。
转化之后，就要对含有外源DNA的重组质粒进行鉴定。可以通过以下步骤来鉴别：先将转化的细胞涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，只有那些带有完整的pBR322质粒或是插入有外源DNA片段的pBR322质粒的细胞可以在培养基上生长；没有转化的细胞就会被氨苄青霉素杀死。由于Bam Hl位点是在四环素抗性基因中，因此，如果DNA插入到这个基因中，就会破坏四环素抗性基因，四环素的抗性就会丢失，所以带有外源DNA的质粒的受体细胞对氨苄青霉素有抗性，但对四环素没有抗性。那些带有自身环化的质粒DNA的细胞既有氨苄青霉素的抗性，同时也有四环素抗性。
第二步是把长在含有氨苄青霉素的培养基上的克隆转移到含有四环素的培养基上，如果在含有四环素的平板上生长，该克隆就带有自身环化的pBR322，因为这些细胞对两种抗生素都有抗性。而那些只在氨苄青霉素平板上生长，而在四环素平板上不能生长的克隆就是带有外源DNA的重组质粒的克隆。重复第二步筛选步骤，就可以较为确定地筛选出那些带有特异地插入的外源DNA的重组质粒。在pBR322质粒上的HindⅢ和Sal I的位点也同样可以作为克隆的位点。
问题8：天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗?为什么?
解析：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒，即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢?其实不然，作为基因工程使用的载体必须满足以下条件。
(1)载体DNA必须有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目 的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插人而失活。
(2)载体DNA必须具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。
(3)载体DNA必须带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。
(4)载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。
(5)载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
问题9：转基因技术中为什么常常选择在动物乳汁中生产重要的医用蛋白?
解析：人们之所以要选择乳腺来生产药物蛋白，原因很多。首先，乳汁可以由乳腺不断地分泌，而且产量很高，长期收集也不会对动物造成伤害；其次，将新的药物蛋白限制在乳腺内生产，最后分泌到乳汁中，一般不易对转基因动物的正常生理活动造成影响。此外，乳腺分泌的蛋白质是经过正常的高等哺乳动物的翻译后加工的，这使得生产的药物蛋白更接近于人类自身的蛋白质。再有，乳汁中蛋白纯化起来相对较为容易，而且在乳汁中含有的其他蛋白质也不多。
问题10：利用显微注射法注入外源基因后培养获得的转基因小鼠为什么并不都产生预期的性状?
解析：由于微注射法所注射的DNA在宿主基因组中是随机整合的，并且有可能发生多个拷贝插入同一位点的情况，因此转入基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，从而干扰该基因的正常表达，影响转基因动物的正常发育和代谢。另外，有的外源基因的表达具有时间性，得到的转基因动物可能只在一段时期内表达外源基因；有些个体可能因基因插入位点不合适而无法表达产物；还有些个体基因拷贝数过多导致表达过量，干扰自身的正常生理活动。因此，并不是所有的转基因小鼠都能产生预期的性状。由于这些原因，DNA微注射法的总效率还是比较低，但是这种方法仍然是目前获得转基因鼠的常规方法。
问题11：如何利用染色体上整合了外源基因的转基因鼠获得纯合的转基因鼠?
解析：将转基因鼠之间进行杂交，子代再配对杂交。根据孟德尔遗传定律，将有1／4的可能获得纯合的转基因鼠(转入基因可以和正常基因一样分离)，如图6所示。
问题12：Bt毒蛋白基因是目前世界范围内培养转基因植物使用最广泛、最有潜力的一个抗虫基因，但使用过程中也存在不少问题，首先，Bt毒蛋白基因的抗虫谱窄，每一种毒素基因只能针对一类害虫；其次，随着转Bt毒蛋白基因植物的大面积种植，给昆虫造成很高的选择压力，可能很快会使昆虫对此毒蛋白产生抗性。针对这些情况，人们可以采取哪些应对措施?
解析：人们需要对大田种植转基因作物后的昆虫数量加以密切监测，以便跟踪了解抗性昆虫的产生频率。如果产生抗性昆虫的频率很高，那么最终可能会需要效力更强的苏云杆菌原毒素，甚至需克隆其他的杀虫基因来转化植物。针对以上问题，人们采取了一些措施，主要包括以下5点：
(1)分离新的Bt毒蛋白基因。抗虫基因越多，可供选择的范围就越广。
(2)对Bt毒蛋白基因进行分子改造，提高其表达量。如使用高效表达启动子，或者使用植物偏爱密码子，或者对不同来源的Bt毒蛋白基因进行人工拼接和重组。
(3)同时使用两个以上的Bt毒蛋白基因转化农作物，或将Bt毒蛋白基因与其他抗虫基因联合进行转基因。
(4)使Bt毒蛋白基因只在容易被害虫侵染组织器官中特异表达，或者只在发育的某个阶段，或受伤时表达，称为降压法，即降低对昆虫的选择压力，以降低抗性昆虫出现的频率。
(5)用不同表达水平来控制。用Bt毒蛋白基因表达量很高的植物以杀死任何可能产生抗性的昆虫，或用低致死量的转基因植物抑制昆虫生长，以利于其他天敌对其捕食。
同时，在大田里种植转基因抗虫作物时，还可以考虑以下措施：
(1)轮换法：抗虫基因作物与化学杀虫剂交替使用，使毒素基因表达产物对昆虫的选择压力间断；
(2)避护法：转基因作物与非转基因作物混播，使抗虫昆虫品系难以发展；
(3)淘汰法：在昆虫抗性产生以前，淘汰此种抗虫作物。
问题1：在现代生物技术应用中，利用最多的就是在细菌细胞中生产真核蛋白，比如人胰岛素和生长激素。但是，真核基因的核基因序列却很少直接用来做表达蛋白质的工作，这是为什么?
第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。
第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。
第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。
问题3：为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA?
解析：迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵，达到保护自身的目的。
问题4：为什么在分子克隆实验中使用最普遍的是那些识别4个或6个碱基对的限制性内切酶?
解析：限制性内切酶的识别位点可以是4个、5个、6个、8个甚至更多的碱基对(表1)。由于限制性内切酶的识别位点在DNA分子中出现的频率不同，即识别位点序列短的限制性内切酶就会更频繁地切割DNA分子，因此，在分子克隆实验中使用最普遍的是那些识别4个或6个碱基对的限制性内切酶。
问题5：如何构建基因文库?
解析：在原核生物中，结构基因通常会在基因组DNA上形成一个连续的编码区域，但在真核细胞中，外显子往往会被内含子分开。因此在处理原核基因和真核基因的分离时，要分别采取不同的克隆步骤。
在原核细胞中，目的DNA通常在总的染色体DNA中的含量非常少(小于0.02％)。要克隆原核基因，首先要用限制性内切酶对总DNA酶解，然后把这些酶解的DNA片段克隆转进载体，再对带有外源DNA片段的重组克隆进行鉴定、分离、再培养和进一步鉴定。整个过程称为基因文库的构建。从定义上讲，一个完整的基因文库应该包括目的生物体所有的基因组DNA。
构建基因文库大多采用一种识别4个碱基序列的限制性内切酶(如Sau3A I)进行酶解，理论上讲它应该是每256个碱基就切一次，调整酶解反应的条件可以使它部分酶解基因组DNA，产生出所有的可能大小的片段(图4)。由于限制性内切酶的位点在基因组DNA上并不是随机排列的，有些片段可能会太大而无法克隆，这时文库就不完整，要找到某一个特异的目的DNA片段也许就要难一些。
问题6：目的基因为何必须和运载体结合形成重组DNA才导人受体细胞?
解析：基因表达载体构建的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。要想使新的重组DNA分子在宿主细胞中保存下去，就要求这两个不同来源的DNA分子中至少有一个分子必须提供其在细胞中保存下来所需的生物学功能，这个分子就是基因工程中常用的载体。
问题7：运输基因的载体上为何常带有一个或多个标记基因?
解析：运载体上的特殊的遗传标记基因，可供重组DNA的鉴定与选择。这里以外源DNA插入到pBR322的Barn HI位点中为例来加以说明：图5是pBR322质粒结构示意图：pBR322质粒含有两个抗生素抗性基因(抗氨苄青霉素和抗四环素)；还有单一的Barn Hl、HindⅢ和Sal I的识别位点，这3个位点都在四环素抗性基因内；另一个单一的Pst I识别位点在氨苄青霉素抗性基因内。pBR322带有一个复制起始位点，它可以保证这个质粒只在大肠杆菌里行使复制功能。
转化之后，就要对含有外源DNA的重组质粒进行鉴定。可以通过以下步骤来鉴别：先将转化的细胞涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，只有那些带有完整的pBR322质粒或是插入有外源DNA片段的pBR322质粒的细胞可以在培养基上生长；没有转化的细胞就会被氨苄青霉素杀死。由于Bam Hl位点是在四环素抗性基因中，因此，如果DNA插入到这个基因中，就会破坏四环素抗性基因，四环素的抗性就会丢失，所以带有外源DNA的质粒的受体细胞对氨苄青霉素有抗性，但对四环素没有抗性。那些带有自身环化的质粒DNA的细胞既有氨苄青霉素的抗性，同时也有四环素抗性。
第二步是把长在含有氨苄青霉素的培养基上的克隆转移到含有四环素的培养基上，如果在含有四环素的平板上生长，该克隆就带有自身环化的pBR322，因为这些细胞对两种抗生素都有抗性。而那些只在氨苄青霉素平板上生长，而在四环素平板上不能生长的克隆就是带有外源DNA的重组质粒的克隆。重复第二步筛选步骤，就可以较为确定地筛选出那些带有特异地插入的外源DNA的重组质粒。在pBR322质粒上的HindⅢ和Sal I的位点也同样可以作为克隆的位点。
问题8：天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗?为什么?
解析：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒，即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢?其实不然，作为基因工程使用的载体必须满足以下条件。
(1)载体DNA必须有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目 的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插人而失活。
(2)载体DNA必须具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。
(3)载体DNA必须带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。
(4)载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。
(5)载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
问题9：转基因技术中为什么常常选择在动物乳汁中生产重要的医用蛋白?
解析：人们之所以要选择乳腺来生产药物蛋白，原因很多。首先，乳汁可以由乳腺不断地分泌，而且产量很高，长期收集也不会对动物造成伤害；其次，将新的药物蛋白限制在乳腺内生产，最后分泌到乳汁中，一般不易对转基因动物的正常生理活动造成影响。此外，乳腺分泌的蛋白质是经过正常的高等哺乳动物的翻译后加工的，这使得生产的药物蛋白更接近于人类自身的蛋白质。再有，乳汁中蛋白纯化起来相对较为容易，而且在乳汁中含有的其他蛋白质也不多。
问题10：利用显微注射法注入外源基因后培养获得的转基因小鼠为什么并不都产生预期的性状?
解析：由于微注射法所注射的DNA在宿主基因组中是随机整合的，并且有可能发生多个拷贝插入同一位点的情况，因此转入基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，从而干扰该基因的正常表达，影响转基因动物的正常发育和代谢。另外，有的外源基因的表达具有时间性，得到的转基因动物可能只在一段时期内表达外源基因；有些个体可能因基因插入位点不合适而无法表达产物；还有些个体基因拷贝数过多导致表达过量，干扰自身的正常生理活动。因此，并不是所有的转基因小鼠都能产生预期的性状。由于这些原因，DNA微注射法的总效率还是比较低，但是这种方法仍然是目前获得转基因鼠的常规方法。
问题11：如何利用染色体上整合了外源基因的转基因鼠获得纯合的转基因鼠?
解析：将转基因鼠之间进行杂交，子代再配对杂交。根据孟德尔遗传定律，将有1／4的可能获得纯合的转基因鼠(转入基因可以和正常基因一样分离)，如图6所示。
问题12：Bt毒蛋白基因是目前世界范围内培养转基因植物使用最广泛、最有潜力的一个抗虫基因，但使用过程中也存在不少问题，首先，Bt毒蛋白基因的抗虫谱窄，每一种毒素基因只能针对一类害虫；其次，随着转Bt毒蛋白基因植物的大面积种植，给昆虫造成很高的选择压力，可能很快会使昆虫对此毒蛋白产生抗性。针对这些情况，人们可以采取哪些应对措施?
解析：人们需要对大田种植转基因作物后的昆虫数量加以密切监测，以便跟踪了解抗性昆虫的产生频率。如果产生抗性昆虫的频率很高，那么最终可能会需要效力更强的苏云杆菌原毒素，甚至需克隆其他的杀虫基因来转化植物。针对以上问题，人们采取了一些措施，主要包括以下5点：
(1)分离新的Bt毒蛋白基因。抗虫基因越多，可供选择的范围就越广。
(2)对Bt毒蛋白基因进行分子改造，提高其表达量。如使用高效表达启动子，或者使用植物偏爱密码子，或者对不同来源的Bt毒蛋白基因进行人工拼接和重组。
(3)同时使用两个以上的Bt毒蛋白基因转化农作物，或将Bt毒蛋白基因与其他抗虫基因联合进行转基因。
(4)使Bt毒蛋白基因只在容易被害虫侵染组织器官中特异表达，或者只在发育的某个阶段，或受伤时表达，称为降压法，即降低对昆虫的选择压力，以降低抗性昆虫出现的频率。
(5)用不同表达水平来控制。用Bt毒蛋白基因表达量很高的植物以杀死任何可能产生抗性的昆虫，或用低致死量的转基因植物抑制昆虫生长，以利于其他天敌对其捕食。
同时，在大田里种植转基因抗虫作物时，还可以考虑以下措施：
(1)轮换法：抗虫基因作物与化学杀虫剂交替使用，使毒素基因表达产物对昆虫的选择压力间断；
(2)避护法：转基因作物与非转基因作物混播，使抗虫昆虫品系难以发展；
(3)淘汰法：在昆虫抗性产生以前，淘汰此种抗虫作物。