论文部分内容阅读
目的探讨草酸诱导人肾小管上皮细胞损伤的机制和超微结构特点。方法将培养的人近端肾小管上皮细胞(HK-2)使用高浓度(0.8mmol/L)的草酸处理24小时后,收集HK-2细胞的细胞培养基,使用乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒对草酸和DMSO的细胞毒性进行检测。使用Western Blotting检测HK-2细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD以及GSDMD-N表达水平的变化。使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒和Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒检测各处理组HK-2细胞的亚细胞结构改变。使用透射电镜观察草酸诱导的HK-2细胞损伤的超微结构特点。通过转染NLRP3-SiRNA将HK-2细胞的NLRP3基因沉默,特定浓度(0.8mmol/L)草酸处理24小时后,收集细胞培养基检测LDH浓度,提取HK-2细胞蛋白质,通过Western Blotting检测NLRP3、Caspase-1、GSDMD以及GSDMD-N表达水平变化;通过透射电镜观察草酸对HK-2细胞损伤的表现,并对比NLRP3基因敲除对TUNEL细胞凋亡检测以及Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染检测结果的影响。使用GSDMD-N抑制剂(NSA)预处理HK-2细胞1小时后加草酸处理24小时,使用乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒检测草酸毒性变化,并验证其对TUNEL细胞凋亡检测试剂盒和Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒检测结果的影响。所有数据均使用SPSS 20.0软件进行处理。结果Western Blotting结果显示草酸处理组HK-2细胞NLRP3、Caspase-1和GSDMD-N蛋白质表达水平较对照组细胞明显增高,而GSDMD的表达水平明显降低;敲低NLRP3基因后再加草酸处理,Caspase-1和GSDMD-N的表达水平减低,而GSDMD的表达水平无明显变化,与此同时,NSA+草酸处理组细胞NLRP3和Caspase-1蛋白表达水平升高,GSDMD表达水平降低,GSDMD-N表达水平无明显变化。通过对培养基中LDH浓度检测,发现草酸处理HK-2细胞培养基中LDH浓度升高明显,而NLRP3-SiRNA+草酸处理组和NSA+草酸处理组HK-2细胞培养基中LDH浓度无明显变化。通过TUNEL细胞凋亡检测试剂盒和Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒检测,与对照组相比,发现草酸处理诱导HK-2细胞发生了细胞核内DNA的断裂以及细胞膜完整性的破坏,而NLRP3-SiRNA+草酸处理组细胞未发生核内DNA的断裂以及细胞膜完整性的破坏,同时,NSA+草酸处理组HK-2细胞出现了核内DNA的断裂,但是细胞膜完整性良好。通过对对照组细胞和草酸处理组HK-2细胞行透射电镜观察,发现与对照组相比,草酸处理组细胞中损伤、变形的线粒体个数明显增多的同时,内质网和高尔基体肿胀的发生率也明显升高;同时,我们发现草酸处理组细胞胞质中出现了大量形状、大小不一的自噬体和胞质空泡;观察中还发现,草酸处理组细胞中出现了内含有大量草酸晶体的吞噬体,并且,胞膜上膜孔数目也明显增多;通过对比对照组和草酸处理组HK-2细胞,我们发现草酸处理组的HK-2细胞游离面细胞膜上的微绒毛发生肿胀的比率明显升高,而NLRP3-SiRNA+草酸处理组细胞未见明显上述超微结构的变化。结论草酸可以诱导HK-2细胞内NLRP3炎症小体形成;草酸可以诱导HK-2细胞发生细胞焦亡;GSDMD参与草酸诱导HK-2细胞焦亡的过程中;草酸诱导的HK-2细胞焦亡表现为:线粒体损伤、内质网水肿、高尔基体水肿以及胞质空泡化,同时胞质内自噬体和含有草酸晶体的吞噬体增多,并伴有胞膜膜孔和细胞微绒毛水肿。草酸处理的HK-2细胞中,NLRP3基因通过GSDMD的参与间接的引起了HK-2细胞焦亡,从而促进草酸钙结石病的起病和进展,为临床上草酸钙结石病的预防和治疗提供了新的思路。