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【摘 要】不同的植物组织都有较优化RNA提取方法。本试验以马铃薯普通栽培品种“师大7号”和“Δ5”块茎嫩芽为材料，对原始的SDS酚法进行改良提取总RNA，并与Logeman法比较，通过电泳实验比较提取效果，以确定适合几种植物组织的最优RNA提取方法。结果表明：Logeman法含有轻微的硫氰酸肌盐污染。而改进的SDS酚法优解决了淀粉、多糖、多酚等干扰马铃薯嫩尖总RNA提取的问题。电泳条带结果表明：Logeman法提取的总RNA有部分降解，条带不清晰，部分有托尾现象，改进的SDS酚法提取的RNA条带清晰无托尾，总RNA质量符合后续试验要求。
【关键词】提取RNA马铃薯;改进的SDS酚法;Logeman法
一、前言
马铃薯属于茄科茄属一年生草本块茎植物，主要食用部位是由地下匍匐茎顶端膨大而形成的块茎——营养贮藏器官，淀粉是它的主要贮藏物质。具有粘性强、膨胀力强、而且糊化性能好、糊浆透明度高等一系列优点，又广泛应用于石油、医药、建筑和纺织等系列众多领域。但因为马铃薯松散的淀粉结构，又使其不能在更大范围内发挥更优质的作用，所以现在马铃薯育种的核心问题之一就是进一步改良马铃薯淀粉现有的加工品质。从目前的研究热点和发展趋势来看，在分子水平上研究其淀粉生物合成关键酶及其基因表达已然成为了研究中心。而进行植物分子生物学研究[1]的必要前提就是提取植物组织的 RNA，因为要构建cDNA 文库、进行Northern 杂交、 RT-PCR 等都需要高质量的 RNA 。同时，RNA的提取还有助于获得转录组，作为连接生物功能的蛋白质组和基因组遗传信息的纽带。目前被研究最多最深入的生物体调控方式也就是对转录水平的调控。转录组更能为后续很多研究提供出更多有用的信息。高效提取优质RNA也对转录组的研究有着重要意义。目前常采用的植物总 RNA 提取方法主要有异硫氰酸胍法、TAB法、Chan法、SDS法、Logeman 、苯酚法 、Trizol 法等。此外，一些商业化的试剂盒也被用于植物组织 RNA 的提取。但很多方法在实验过程中，由于马铃薯块茎含有大量的多糖、酚类化合物和次级代谢产物，液氮研磨过程中块茎里大量淀粉会失水成干粉状，加入变性液后干粉迅速吸水呈凝胶状，即使通过高速离心亦无法使其与液相分离，导致 RNA 被包裹其中而无法提取[3]。而块茎中的多糖会使 RNA 沉淀难溶于水，或者溶解后成黏稠状，同时多糖可以抑制许多酶的活性，严重影响后续分子生物学试验 。多酚类化合物在研磨后匀浆时会被释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，被氧化的酚类化合物（如醌类）能与 RNA 稳定结合，从而影响 RNA 的分离纯化[4]。这些物质不仅会影响马铃薯总 RNA 提取的产量和质量，而且会严重干扰后续反转录反应和 PCR 扩增。除此以外，常用的 RNA 提取方法对于处理马铃薯块茎此类的特殊材料， 还存在分离产量低和污染严重等问题。 本试验采用 Logeman法和改进的SDS酚法提取马铃薯嫩尖 RNA ， 并对这两种方法的提取效果进行比较与分析，并通过电泳验证提取所得的总RNA质量。结果表明，Logeman法虽然能提取较多RNA，但其电泳结果并没有改进的SDS酚法提取的RNA質量好，且存在拖尾现象，条带不清晰。一般的实验环境条件下，改良的SDS酚法更有利于多酚类植物RNA的提取。
二、实验过程
1.准备过程：（1）外界环境RNase 的灭活：RNA提取的前处理。RNA提取过程中所用研钵、药匙、玻璃器皿于180℃干热处理了4h;（2）塑料容器、耗材及配制药品的H2O均用终浓度为0.1%的DEPC处理过夜，并用烘箱烘干;（3）试验材料及仪器的预冷：将剪刀剪下的马铃薯嫩尖样品用1%DEPC水浸泡清洗后，晾干待用;（4）将研钵用液氮进行预冷处理。
2.实验过程：（1）改良的SDS酚法;（2）Logeman法;（3）凝胶制作;（4）电泳过程。
三、实验数据分析
（一）一种方法提取马铃薯块茎总RNA完整性比较
将改良的SDS酚法、Logeman 法提取的马铃薯块茎总 RNA 各2μL，分别加水 10 μL，再加2μL DEPC缓冲液，在1.0% 琼脂糖凝胶上电泳。由电泳结果可以看出，Logeman 法提取的两个品种的 RNA 有严重拖尾现象，改良的SDS酚法提取的 RNA 条带相对清晰，且师大7号形成的条带比Δ5形成的条带要清晰，但查阅相关文献得知，导致这种结果的原因是实验过程中操作不当或者Δ5提取的RNA降解相对较快，但总的来说，本实验提取出的RNA可以作对比所用。
现在用的是DNA的markertk，但并不影响比较过程，结果仅供参考。
本图示中“1”为改进的SDS酚法提取“师大7号”的RNA电泳结果;
“2”为Logeman 法提取的“师大7号”的RNA电泳结果;
“3”为改进的SDS酚法提取“Δ5”的RNA电泳结果;
“4”为Logeman 法提取“Δ5”的RNA电泳结果;
（二）两种方法提取马铃薯块茎操作程序比较（表2）
Logeman法、改进的SDS酚法种方法都经过研磨、抽提、沉淀、洗涤等步骤，各方法只有研磨一致，其余步骤都有所区别，导致试验时间差异较大，但改进的SDS酚法各种实验试剂步骤相对更适合现代实验室操作。
四、结论
Logeman法利用盐酸胍、β-巯基乙醇2 种试剂来抑制 RNase 活性，同时裂解核蛋白，酚、氯仿反复抽提去除蛋白质，醋酸和乙醇选择性沉淀 RNA，然后再用 3 mol/L 醋酸钠（pH值为5.2）去除多糖，可大量提取马铃薯块茎总 RNA。但本实验中Logeman 法未得到较高质量的 RNA，原因在于实验操作过程中可能存在误差，且降解程度较大，相比之下，没有改进的SDS酚法提取RNA的效果好。但其成本较低，且耗时相对较少，也不失为一个规范操作以提取RNA的好方法。
改进的SDS酚法用异丙醇两次，最后对沉淀洗涤两次，且电泳结果表明：改进的SDS酚法提取的RNA完整性相对较好;整个过程无试剂污染，更适合于实验室操作。
【参考文献】
[1]赵宝勰，程李香，林必博，等. 两种马铃薯块茎总 RNA 提取方法的比较[J]. 广东农业科学，2010 （1）：124 -127.
[2]王关林，方宏筠. 植物基因工程原理和技术[M]. 北京：科学出版社，1998：609.
[3]杨建文，宋波涛，李亚军，等. 一种简单有效的提取马铃薯块茎总RNA 方法[J]. 农业生物技术学报，2006，14 （2）：297 -298.
[4]赵亚力，马学斌. 分子生物学基本实验技术[M]. 北京：清华大学出版社，2006：49 -53.
作者简介：兰成苑、性别：女、籍贯：四川内江、研究方向：教育;胡艳燕、性别：女、籍贯：江西抚州、研究方向：教育;帅港航、性别：男、籍贯：四川德阳、研究方向：生物教育;王用帅、性别：男、籍贯：四川资阳、研究方向：教育。
【关键词】提取RNA马铃薯;改进的SDS酚法;Logeman法
一、前言
马铃薯属于茄科茄属一年生草本块茎植物，主要食用部位是由地下匍匐茎顶端膨大而形成的块茎——营养贮藏器官，淀粉是它的主要贮藏物质。具有粘性强、膨胀力强、而且糊化性能好、糊浆透明度高等一系列优点，又广泛应用于石油、医药、建筑和纺织等系列众多领域。但因为马铃薯松散的淀粉结构，又使其不能在更大范围内发挥更优质的作用，所以现在马铃薯育种的核心问题之一就是进一步改良马铃薯淀粉现有的加工品质。从目前的研究热点和发展趋势来看，在分子水平上研究其淀粉生物合成关键酶及其基因表达已然成为了研究中心。而进行植物分子生物学研究[1]的必要前提就是提取植物组织的 RNA，因为要构建cDNA 文库、进行Northern 杂交、 RT-PCR 等都需要高质量的 RNA 。同时，RNA的提取还有助于获得转录组，作为连接生物功能的蛋白质组和基因组遗传信息的纽带。目前被研究最多最深入的生物体调控方式也就是对转录水平的调控。转录组更能为后续很多研究提供出更多有用的信息。高效提取优质RNA也对转录组的研究有着重要意义。目前常采用的植物总 RNA 提取方法主要有异硫氰酸胍法、TAB法、Chan法、SDS法、Logeman 、苯酚法 、Trizol 法等。此外，一些商业化的试剂盒也被用于植物组织 RNA 的提取。但很多方法在实验过程中，由于马铃薯块茎含有大量的多糖、酚类化合物和次级代谢产物，液氮研磨过程中块茎里大量淀粉会失水成干粉状，加入变性液后干粉迅速吸水呈凝胶状，即使通过高速离心亦无法使其与液相分离，导致 RNA 被包裹其中而无法提取[3]。而块茎中的多糖会使 RNA 沉淀难溶于水，或者溶解后成黏稠状，同时多糖可以抑制许多酶的活性，严重影响后续分子生物学试验 。多酚类化合物在研磨后匀浆时会被释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，被氧化的酚类化合物（如醌类）能与 RNA 稳定结合，从而影响 RNA 的分离纯化[4]。这些物质不仅会影响马铃薯总 RNA 提取的产量和质量，而且会严重干扰后续反转录反应和 PCR 扩增。除此以外，常用的 RNA 提取方法对于处理马铃薯块茎此类的特殊材料， 还存在分离产量低和污染严重等问题。 本试验采用 Logeman法和改进的SDS酚法提取马铃薯嫩尖 RNA ， 并对这两种方法的提取效果进行比较与分析，并通过电泳验证提取所得的总RNA质量。结果表明，Logeman法虽然能提取较多RNA，但其电泳结果并没有改进的SDS酚法提取的RNA質量好，且存在拖尾现象，条带不清晰。一般的实验环境条件下，改良的SDS酚法更有利于多酚类植物RNA的提取。
二、实验过程
1.准备过程：（1）外界环境RNase 的灭活：RNA提取的前处理。RNA提取过程中所用研钵、药匙、玻璃器皿于180℃干热处理了4h;（2）塑料容器、耗材及配制药品的H2O均用终浓度为0.1%的DEPC处理过夜，并用烘箱烘干;（3）试验材料及仪器的预冷：将剪刀剪下的马铃薯嫩尖样品用1%DEPC水浸泡清洗后，晾干待用;（4）将研钵用液氮进行预冷处理。
2.实验过程：（1）改良的SDS酚法;（2）Logeman法;（3）凝胶制作;（4）电泳过程。
三、实验数据分析
（一）一种方法提取马铃薯块茎总RNA完整性比较
将改良的SDS酚法、Logeman 法提取的马铃薯块茎总 RNA 各2μL，分别加水 10 μL，再加2μL DEPC缓冲液，在1.0% 琼脂糖凝胶上电泳。由电泳结果可以看出，Logeman 法提取的两个品种的 RNA 有严重拖尾现象，改良的SDS酚法提取的 RNA 条带相对清晰，且师大7号形成的条带比Δ5形成的条带要清晰，但查阅相关文献得知，导致这种结果的原因是实验过程中操作不当或者Δ5提取的RNA降解相对较快，但总的来说，本实验提取出的RNA可以作对比所用。
现在用的是DNA的markertk，但并不影响比较过程，结果仅供参考。
本图示中“1”为改进的SDS酚法提取“师大7号”的RNA电泳结果;
“2”为Logeman 法提取的“师大7号”的RNA电泳结果;
“3”为改进的SDS酚法提取“Δ5”的RNA电泳结果;
“4”为Logeman 法提取“Δ5”的RNA电泳结果;
（二）两种方法提取马铃薯块茎操作程序比较（表2）
Logeman法、改进的SDS酚法种方法都经过研磨、抽提、沉淀、洗涤等步骤，各方法只有研磨一致，其余步骤都有所区别，导致试验时间差异较大，但改进的SDS酚法各种实验试剂步骤相对更适合现代实验室操作。
四、结论
Logeman法利用盐酸胍、β-巯基乙醇2 种试剂来抑制 RNase 活性，同时裂解核蛋白，酚、氯仿反复抽提去除蛋白质，醋酸和乙醇选择性沉淀 RNA，然后再用 3 mol/L 醋酸钠（pH值为5.2）去除多糖，可大量提取马铃薯块茎总 RNA。但本实验中Logeman 法未得到较高质量的 RNA，原因在于实验操作过程中可能存在误差，且降解程度较大，相比之下，没有改进的SDS酚法提取RNA的效果好。但其成本较低，且耗时相对较少，也不失为一个规范操作以提取RNA的好方法。
改进的SDS酚法用异丙醇两次，最后对沉淀洗涤两次，且电泳结果表明：改进的SDS酚法提取的RNA完整性相对较好;整个过程无试剂污染，更适合于实验室操作。
【参考文献】
[1]赵宝勰，程李香，林必博，等. 两种马铃薯块茎总 RNA 提取方法的比较[J]. 广东农业科学，2010 （1）：124 -127.
[2]王关林，方宏筠. 植物基因工程原理和技术[M]. 北京：科学出版社，1998：609.
[3]杨建文，宋波涛，李亚军，等. 一种简单有效的提取马铃薯块茎总RNA 方法[J]. 农业生物技术学报，2006，14 （2）：297 -298.
[4]赵亚力，马学斌. 分子生物学基本实验技术[M]. 北京：清华大学出版社，2006：49 -53.
作者简介：兰成苑、性别：女、籍贯：四川内江、研究方向：教育;胡艳燕、性别：女、籍贯：江西抚州、研究方向：教育;帅港航、性别：男、籍贯：四川德阳、研究方向：生物教育;王用帅、性别：男、籍贯：四川资阳、研究方向：教育。