论文部分内容阅读
摘要：采用反相高效液相色谱法（RP-HPLc）建立同时测定植物油中菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇含量的方法。采用C8柱（250mmx4.6mmx5um）为色谱柱，流动相A相为乙腈，B相为水，通过梯度洗脱方式，以流量为1ml/min，紫外检测波长210nm对植物油中菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇进行分离检测。结果表明，菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的质量浓度范围分别为5.12～101.4，5.08～101.6，5.09～101.8ug/mL时，3个甾醇的线性关系良好（线性方程分别为y=3699x-5454，y=4951x+8889，y=399x-3800；相关系数r2分别为O.9989，O.9999，O.9994），检测限为2.5ug/mL，平均回收率分别为99.79%～100.6%，98.17%～99.80%以及97.76%～102.24%，进样精密度（n=6）分别为2.29%，1.66%，2.12%，重复性RSD分别为2.49%，1.78%，2.72%，稳定性RSD分别为1.95%，2.56%，2.40%。通过对12种植物油中3种甾醇含量进行同时测定，表明相对于气相色谱法（GC），采用HPlC法具有更稳定、更准确、更简便等特点，是同时检测植物油中菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的较好方法。
关键词：植物油；菜油甾醇；豆甾醇；β-谷甾醇；反相高效液相色谱
文献标志码：A
文章编号：1674-5124（2016）04-0060-05
0.引言
植物甾醇是一类植物活性成分，具有调节免疫、降低血脂和胆固醇、抗肿瘤、抗氧化以及护肤等功能。Sriraman等研究发现，竹叶中的植物甾醇具有很大的雌激素活性。Cynthia T.Srigley等测定了市场上一些食品以及食品添加剂中5种主要植物甾醇的含量，从而为美国食品药品监督管理局（FDA）对于植物甾醇治疗冠心病的疗效提供了数据支持。目前研究已鉴定出200多种植物甾醇包括B一谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇等；其中B一谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇是植物中含量最多的甾醇。总之，植物甾醇具有十分独特的生理活性，在医药、化妆、食品昀等行业中应用广泛。
植物甾醇是一类以环戊烷全氢菲为骨架的三萜类化合物，多数甾醇双键在C-5位上，而在C-3位存在羟基，且羟基是其主要的活性基团。由于甾醇的化学结构非常相似，而且部分以甾醇酯（脂肪酸酯和酚酸酯）的形式存在罔，因此需要对甾醇样品进行特殊处理且配合适合的检测方法，才能对甾醇含量进行完整的分析测定。
目前，植物甾醇分析的主要流程通常是脂质分离，加碱皂化，甾醇衍生化等。在前处理方法中，最早使用溶剂结晶㈣、超声波辅助萃取、皂化等方法，随着科技的发展，超临界流体萃取、分子蒸馏法等新兴手段也逐渐运用到了甾醇的提取中。对于甾醇的检测方法来说，运用薄层色谱法、气相色谱法以及高效液相色谱法对甾醇的研究取得了重大进展。薄层色谱法由于操作繁琐，显色后不稳定，仍难以满足现代分析的要求。气相色谱法虽分辨率高，热稳定性好㈣，但需要进行衍生化，同时操作温度较高，测量过程中可能会破坏样品分子结构，因此对于甾醇的测量会产生一定影响。而高效液相色谱法操作简便，结果可靠，稳定性好，能够与不同的检测器联用从而对不同物质中的植物甾醇进行分析，且不需要对甾醇进行衍生化即可直接进样。
本文首次采用反相高效液相色谱法对常见的12种植物油中菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇含量进行了测定，以期对植物油中植物甾醇的研究提供参考。
1.实验部分
1.1仪器与试药
LC-2010A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；CPA225D型电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；B-220型恒温水浴锅（上海雅荣生化设备仪器有限公司）；KLl0260D型超声波清洗机：TGL-16G型离心机（上海安亭科学仪器厂）。标准品：菜油甾醇和B一谷甾醇（成都市普思生物科技股份有限公司，纯度：>98.5%）：豆甾醇（北京世纪奥科生物技术有限公司，纯度：>95%）。乙腈（广东光华化学试剂有限公司，色谱纯），其他试剂均为分析纯。亚麻籽油、紫苏油、小麦胚芽油、沙棘油、火麻籽油、青刺果油、橄榄油、杏仁油、葡萄籽油、山茶籽油以及月见草油样品经市售获得，清脉油由成都悟道科技有限公司提供。
1.2溶液配制
1）对照品溶液。分别称取菜油甾醇、豆甾醇和B一谷甾醇对照品适量于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，于4℃下冷藏备用。
2）供试品溶液。取约1.0g样品油于锥形瓶中，加入2.0mol/L氢氧化钾一乙醇溶液10ml，在沸水浴中皂化30min，冷却后加入水10mL，并移入分液漏斗中，用10mL正己烷分两次萃取，合并萃取液，精密量取萃取液2mL，挥干，用甲醇定容于10mL容量瓶中，用0.2um微孔滤膜过滤，用于HPLC进样。
1.3色谱条件
色谱柱：Agilent C8（250 mmx4.6 mmx5um）；流动相：A相为乙腈，B相为水，采用梯度洗脱，0～120min 75%～85%A相，120-160min 85%A相：流量：1mL/min；检测波长：210nm；柱温：35℃：进样量：20 IxL。在上述条件下，对照品以及样品色谱图见图1。结果表明，此条件下菜油甾醇、豆甾醇和B一谷甾醇的分离度均大于1.5，拖尾因子均在1.0左右，达到了定量分析的要求，故该方法可用于上述3种成分的含量测定。
2.方法与结果2.1线性关系试验
分别量取1.2项下3种甾醇对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，2.0mL于10mL容量瓶中，加甲醇稀释成一定梯度的系列混合对照品溶液，如表1所示。分别精密量取系列对照品溶液20 IxL，按照1.3项下色谱条件进行测定，分别以3种植物甾醇质量浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标进行回归分析，得出回归方程以及相关系数见表2。 2.2精密度试验
分别取菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇对照品溶液，重复进样，记录峰面积，计算RSD值。结果表明菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇峰面积RSD值分别为2.29%，1.66%，2.12%，说明该方法精密度良好。
2.3重复性试验
称取杏仁油适量，按照1.2项下供试品制备方法进行处理，按照1.3项下的色谱条件进样，平行测定5次，记录峰面积，并计算RSD值。结果显示菜油甾醇、豆甾醇和B一谷甾醇峰面积RSD值分别2.49%，1.78%，2.72%。
2.4稳定性试验
称取杏仁油适量，按照1.2项下供试品制备方法进行处理，按照1.3项下的色谱条件，分别于0，2，4，6，8，12h进样，记录峰面积，计算RSD值。结果显示供试品中菜油甾醇、豆甾醇和B一谷甾醇峰面积的RSD值分别为1.95%，2.56%，2.40%，表明供试品溶液在12h内稳定。
2.5加样回收率试验
取杏仁油适量，精密称定，加2.0mol/L氢氧化钾一乙醇溶液稀释，制成9份均分为3组，分别加入3个不同水平的菜油甾醇、豆甾醇和B一谷甾醇对照品混合液，按照1.2项下供试品制备方法进行处理，1.3项下的色谱条件测定，记录色谱图，计算得加样回收率，如表3所示。
3.讨论
由于植物中的部分甾醇以甾醇酯的形式存在，要进行色谱检测必须先水解成游离甾醇。同时，由于植物甾醇存在于复杂的植物基质中，许多不皂化物如游离脂肪酸、甘油酸酯、胶质以及蜡质等都会对植物甾醇的分离检测产生影响旧：因此，有必要将样品经过一定的处理后再进行测定。本实验在甾醇提取过程中，确定皂化条件为100℃皂化30rain。
菜油甾醇和豆甾醇的化学结构非常接近，豆甾醇仅在支链上比菜油甾醇多出了一个甲基，分子量相差12，是分离中的难点。在等度洗脱下，不同的流动相皆不能有效分离菜油甾醇和豆甾醇，同时也不能分离谷甾醇与附近的杂质。采用梯度洗脱，3种植物甾醇得到了有效分离，分离度达1.5以上，满足含量测定要求。
由表4可知，12种植物油中均含有B一谷甾醇，但3种甾醇含量分布各有不同。其中，小麦胚芽油中无论是总甾醇量还是β-谷甾醇量和菜油甾醇量皆最高，总甾醇量是其他油甾醇量的5倍。甾醇含量最少的为青刺果油，仅含有少量的β-谷甾醇。同时，豆甾醇在12种植物油中含量普遍不高，而沙棘油、山茶籽油以及青刺果油中仅含有B一谷甾醇，山茶籽油中β-谷甾醇含量较多达到1.169 mg/g。值得注意的是，清脉油即多种油组成的混合油，其总甾醇量排在表中的第4位，达到1.35 mg/g，菜油甾醇和谷甾醇均排在第4位，豆甾醇排在第5位，表现出混合后的清脉油在甾醇的分布上具有较好的均衡性和高品质性。由于β-谷甾醇具有抗氧化、抗感染、免疫调制、退热以及抗肿瘤的作用，对血糖的控制能起到很好的作用，豆甾醇对于肝癌细胞也有一定的控制作用旧；因此，以菜油甾醇、豆甾醇和B一谷甾醇为测量指标来对植物油进行品质评价是十分可行的。
4.结束语
综上，本文建立了高效液相色谱法对植物油中的菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的同时定量方法，具有操作简便、灵敏度较高、专属性较强和准确度较高等特点。能够较好地展现出12种常见植物油中3种甾醇的分布规律，显示出不同植物油中甾醇含量不同，进而说明食用植物油营养价值的差异性。本方法可为植物油的质量控制提供甾醇指标的参考，对提高食品质量标准具有现实意义。
关键词：植物油；菜油甾醇；豆甾醇；β-谷甾醇；反相高效液相色谱
文献标志码：A
文章编号：1674-5124（2016）04-0060-05
0.引言
植物甾醇是一类植物活性成分，具有调节免疫、降低血脂和胆固醇、抗肿瘤、抗氧化以及护肤等功能。Sriraman等研究发现，竹叶中的植物甾醇具有很大的雌激素活性。Cynthia T.Srigley等测定了市场上一些食品以及食品添加剂中5种主要植物甾醇的含量，从而为美国食品药品监督管理局（FDA）对于植物甾醇治疗冠心病的疗效提供了数据支持。目前研究已鉴定出200多种植物甾醇包括B一谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇等；其中B一谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇是植物中含量最多的甾醇。总之，植物甾醇具有十分独特的生理活性，在医药、化妆、食品昀等行业中应用广泛。
植物甾醇是一类以环戊烷全氢菲为骨架的三萜类化合物，多数甾醇双键在C-5位上，而在C-3位存在羟基，且羟基是其主要的活性基团。由于甾醇的化学结构非常相似，而且部分以甾醇酯（脂肪酸酯和酚酸酯）的形式存在罔，因此需要对甾醇样品进行特殊处理且配合适合的检测方法，才能对甾醇含量进行完整的分析测定。
目前，植物甾醇分析的主要流程通常是脂质分离，加碱皂化，甾醇衍生化等。在前处理方法中，最早使用溶剂结晶㈣、超声波辅助萃取、皂化等方法，随着科技的发展，超临界流体萃取、分子蒸馏法等新兴手段也逐渐运用到了甾醇的提取中。对于甾醇的检测方法来说，运用薄层色谱法、气相色谱法以及高效液相色谱法对甾醇的研究取得了重大进展。薄层色谱法由于操作繁琐，显色后不稳定，仍难以满足现代分析的要求。气相色谱法虽分辨率高，热稳定性好㈣，但需要进行衍生化，同时操作温度较高，测量过程中可能会破坏样品分子结构，因此对于甾醇的测量会产生一定影响。而高效液相色谱法操作简便，结果可靠，稳定性好，能够与不同的检测器联用从而对不同物质中的植物甾醇进行分析，且不需要对甾醇进行衍生化即可直接进样。
本文首次采用反相高效液相色谱法对常见的12种植物油中菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇含量进行了测定，以期对植物油中植物甾醇的研究提供参考。
1.实验部分
1.1仪器与试药
LC-2010A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；CPA225D型电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；B-220型恒温水浴锅（上海雅荣生化设备仪器有限公司）；KLl0260D型超声波清洗机：TGL-16G型离心机（上海安亭科学仪器厂）。标准品：菜油甾醇和B一谷甾醇（成都市普思生物科技股份有限公司，纯度：>98.5%）：豆甾醇（北京世纪奥科生物技术有限公司，纯度：>95%）。乙腈（广东光华化学试剂有限公司，色谱纯），其他试剂均为分析纯。亚麻籽油、紫苏油、小麦胚芽油、沙棘油、火麻籽油、青刺果油、橄榄油、杏仁油、葡萄籽油、山茶籽油以及月见草油样品经市售获得，清脉油由成都悟道科技有限公司提供。
1.2溶液配制
1）对照品溶液。分别称取菜油甾醇、豆甾醇和B一谷甾醇对照品适量于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，于4℃下冷藏备用。
2）供试品溶液。取约1.0g样品油于锥形瓶中，加入2.0mol/L氢氧化钾一乙醇溶液10ml，在沸水浴中皂化30min，冷却后加入水10mL，并移入分液漏斗中，用10mL正己烷分两次萃取，合并萃取液，精密量取萃取液2mL，挥干，用甲醇定容于10mL容量瓶中，用0.2um微孔滤膜过滤，用于HPLC进样。
1.3色谱条件
色谱柱：Agilent C8（250 mmx4.6 mmx5um）；流动相：A相为乙腈，B相为水，采用梯度洗脱，0～120min 75%～85%A相，120-160min 85%A相：流量：1mL/min；检测波长：210nm；柱温：35℃：进样量：20 IxL。在上述条件下，对照品以及样品色谱图见图1。结果表明，此条件下菜油甾醇、豆甾醇和B一谷甾醇的分离度均大于1.5，拖尾因子均在1.0左右，达到了定量分析的要求，故该方法可用于上述3种成分的含量测定。
2.方法与结果2.1线性关系试验
分别量取1.2项下3种甾醇对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，2.0mL于10mL容量瓶中，加甲醇稀释成一定梯度的系列混合对照品溶液，如表1所示。分别精密量取系列对照品溶液20 IxL，按照1.3项下色谱条件进行测定，分别以3种植物甾醇质量浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标进行回归分析，得出回归方程以及相关系数见表2。 2.2精密度试验
分别取菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇对照品溶液，重复进样，记录峰面积，计算RSD值。结果表明菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇峰面积RSD值分别为2.29%，1.66%，2.12%，说明该方法精密度良好。
2.3重复性试验
称取杏仁油适量，按照1.2项下供试品制备方法进行处理，按照1.3项下的色谱条件进样，平行测定5次，记录峰面积，并计算RSD值。结果显示菜油甾醇、豆甾醇和B一谷甾醇峰面积RSD值分别2.49%，1.78%，2.72%。
2.4稳定性试验
称取杏仁油适量，按照1.2项下供试品制备方法进行处理，按照1.3项下的色谱条件，分别于0，2，4，6，8，12h进样，记录峰面积，计算RSD值。结果显示供试品中菜油甾醇、豆甾醇和B一谷甾醇峰面积的RSD值分别为1.95%，2.56%，2.40%，表明供试品溶液在12h内稳定。
2.5加样回收率试验
取杏仁油适量，精密称定，加2.0mol/L氢氧化钾一乙醇溶液稀释，制成9份均分为3组，分别加入3个不同水平的菜油甾醇、豆甾醇和B一谷甾醇对照品混合液，按照1.2项下供试品制备方法进行处理，1.3项下的色谱条件测定，记录色谱图，计算得加样回收率，如表3所示。
3.讨论
由于植物中的部分甾醇以甾醇酯的形式存在，要进行色谱检测必须先水解成游离甾醇。同时，由于植物甾醇存在于复杂的植物基质中，许多不皂化物如游离脂肪酸、甘油酸酯、胶质以及蜡质等都会对植物甾醇的分离检测产生影响旧：因此，有必要将样品经过一定的处理后再进行测定。本实验在甾醇提取过程中，确定皂化条件为100℃皂化30rain。
菜油甾醇和豆甾醇的化学结构非常接近，豆甾醇仅在支链上比菜油甾醇多出了一个甲基，分子量相差12，是分离中的难点。在等度洗脱下，不同的流动相皆不能有效分离菜油甾醇和豆甾醇，同时也不能分离谷甾醇与附近的杂质。采用梯度洗脱，3种植物甾醇得到了有效分离，分离度达1.5以上，满足含量测定要求。
由表4可知，12种植物油中均含有B一谷甾醇，但3种甾醇含量分布各有不同。其中，小麦胚芽油中无论是总甾醇量还是β-谷甾醇量和菜油甾醇量皆最高，总甾醇量是其他油甾醇量的5倍。甾醇含量最少的为青刺果油，仅含有少量的β-谷甾醇。同时，豆甾醇在12种植物油中含量普遍不高，而沙棘油、山茶籽油以及青刺果油中仅含有B一谷甾醇，山茶籽油中β-谷甾醇含量较多达到1.169 mg/g。值得注意的是，清脉油即多种油组成的混合油，其总甾醇量排在表中的第4位，达到1.35 mg/g，菜油甾醇和谷甾醇均排在第4位，豆甾醇排在第5位，表现出混合后的清脉油在甾醇的分布上具有较好的均衡性和高品质性。由于β-谷甾醇具有抗氧化、抗感染、免疫调制、退热以及抗肿瘤的作用，对血糖的控制能起到很好的作用，豆甾醇对于肝癌细胞也有一定的控制作用旧；因此，以菜油甾醇、豆甾醇和B一谷甾醇为测量指标来对植物油进行品质评价是十分可行的。
4.结束语
综上，本文建立了高效液相色谱法对植物油中的菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的同时定量方法，具有操作简便、灵敏度较高、专属性较强和准确度较高等特点。能够较好地展现出12种常见植物油中3种甾醇的分布规律，显示出不同植物油中甾醇含量不同，进而说明食用植物油营养价值的差异性。本方法可为植物油的质量控制提供甾醇指标的参考，对提高食品质量标准具有现实意义。