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摘要：地衣芽孢杆菌有调节动物肠道内微生态平衡、增强机体的抵抗力、保护动物健康等重要的作用。试验研究了NaC1质量分数、pH值和温度对营养肉汤培养基中地衣芽孢杆菌生长状态的影响。结果表明：地衣芽孢杆菌在营养肉汤中的最佳生长条件为，NaC1质量分数范围为1%，pH值为8.0，最适生长温度为37℃。
关键词：地衣芽孢杆菌;营养肉汤;生长条件
中图分类号：TQ464 文献标识码：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.18.006
0 引言
地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）是一种常见的革兰氏阳性菌。该菌能产生多种生物活性物质，包括多糖、蛋白质、非肽类物质等，它们能促进饲料中营养素降解，提高饲料利用率[1]。此外地衣芽孢杆菌还能产生多种活性酶，这些酶可以促使细胞营养物质的释放，消除饲料中的抗营养物质[2]。在不良环境中，地衣芽孢杆菌可以形成芽孢，经受颗粒饲料加工和储存中一系列恶劣环境。因此，地衣芽孢杆菌被我国农业部2003年318号公告《饲料添加剂品种目录》批准使用为饲料级菌株[3]。
试验研究了地衣芽孢杆菌在营养肉汤培养基中不同温度、不同NaC1质量分数以及不同pH值条件下的生长特性，探索地衣芽孢杆菌的最优生长条件，可以为更好的筛选地衣芽孢杆菌益生菌，研发益生菌制剂提供依据。
1 材料
1.1 试剂
营养肉汤培养基、营养琼脂培养基为杭州百思生物科技有限公司产品。蛋白胨、牛肉浸膏、NaC1、HC1、NaOH、琼脂等为国药集团化学试剂有限公司产品。
1.2 试验菌株
地衣芽孢杆菌菌种为本实验室保存，分离于60日龄樱桃谷鸭的小肠。
2 方法
2.1 制备种子液
从保存菌种的斜面培养基上挑取菌落，接种于营养琼脂培养基，37℃培养24h。挑取扁平、边缘整齐、表面光滑、粘稠，呈乳白色的菌落，接种于营养肉汤培养基中，37℃培养24h。取该培养物，用无菌的生理盐水将其稀释至102～103cfu/mL，即为种子液。
2.2 平板菌落计数
在无菌操作下，将地衣芽孢杆菌待测样品10倍梯度稀释，吸取0.2mL不同稀释梯度的培养液均匀涂布在营养琼脂培养基上，每个梯度做2个平行，然后放置于培养箱中倒置培养。48h后记录每个平板中菌落数量，并且计算出菌落总数。
2.3 温度对地衣芽孢杆菌生长的影响
取7支相同规格试管，每支试管加入9.8mL营养肉汤培养基，121℃灭菌15min。待冷却后每支试管接种0.2mL种子液，分别置于10、15、20、25、30、37、45℃摇床中，180r/min振荡培养12h。每支试管各取1mL培养液，梯度稀释后进行平板菌落计数。
2.4 NaC1质量分数对地衣芽袍杆菌生长的影响
配制NaC1质量分数分别为0.5%、1%、3%、5%、7%、9%、12%的营养肉汤培养基。取7支相同规格试管，每个质量分数的营养肉汤培养基分别取9.8mL装于试管，121℃灭菌15min。待冷却后每支试管接种0.2mL种子液，置于37℃摇床中，180r/min荡培养24h。每支试管各取1mL培养液，梯度稀释后进行平板菌落计数。
2.5 pH值对地衣芽袍杆菌生长的影响
配制营养肉汤培养基，用1mol/L的HC1和1mol/L的NaOH将pH值分别调整为2、4、5、7、8、9、11。取7支相同规格试管，每个pH值营养肉汤培养基分别取9.8mL装于试管，121℃灭菌15min。待冷却后每支试管接种0.2mL种子液，置于37℃摇床中，180r/min振荡培养24h。每支试管各取1mL培养液，梯度稀释后进行平板菌落计数。
3 結果与分析
3.1 温度对地衣芽孢杆菌生长的影响
从10～37℃，地衣芽孢杆菌的生长状态呈现不断上升的趋势，而当37～45℃时，地衣芽孢杆菌的生长状态呈现下降趋势，见图1。其中在10～25℃范围内生长较为缓慢，在25～30℃范围中生长良好，最优生长温度为30～37℃;而当温度到达45℃左右，地衣芽孢杆菌的生长状态几乎停止。由此可知，地衣芽孢杆菌的最适生长温度为37℃，见表1。
3.2 NaCI质量分数对地衣芽孢杆菌生长的影响
地衣芽孢杆菌的生长状态随着NaC1质量分数的增高而呈现逐渐下降的趋势，见图2。NaC1质量分数在0.5%～3%间生长较为良好，在3%～7%，地衣芽孢杆菌的生长一般，在7%～12%生长状态不良。由此可知，地衣芽孢杆菌最适NaC1质量分数为1%，见表2。
3.3 pH值对地衣芽孢杆菌生长的影响
APH值2.0～8.0范围内，地衣芽孢杆菌的生长随着pH值的增大而呈现逐渐上升的趋势;而在PF3值为8.0～11.0范围内，其生长状态开始下降。其中在pH值为2.0～3.0，地衣芽孢杆菌基本不生长，pH值为4.0～5.0时生长逐渐开始增快，pH值在5.0～9.0范围内生长状态较好，pH为8.0时达到最大值。pH值大于9.0以后生长受到抑制，至pH值11.0时几乎停止生长。由此可知，地衣芽孢杆菌最适生长pH值为8.0。见图3、表3。
4 讨论
随着人们生活水平的提高和对健康的重视，益生菌作为绿色饲料添加剂越来越受到人们的青睐，益生菌的开发和应用必将对我国养殖业的发展起到积极作用[4]。地衣芽孢杆菌是一种安全、有效、抗逆性强、营养要求低的一种益生菌。试验讨论了营养肉汤培养基中不同的温度、NaC1质量分数、不同pH值条件对地衣芽孢杆菌生长状况的影响，便于我们对益生菌制剂的研发。
5 结论
随着温度的上升，地衣芽孢杆菌的生长状态不断上升，超过37℃后，地衣芽孢杆菌的生长状态呈现下降趋势。而当温度到达45℃左右，生长状态几乎停止。由此可知，地衣芽孢杆菌对温度的耐受性较高。随着NaC1质量分数增加，地衣芽孢杆菌的生长状态呈现下降趋势。NaC1质量分数在0一3%范围内生长最好，超过10%后，生长状态几乎停止。由此可知，地衣芽孢杆菌对NaC1的耐受性较高。随着pH值的上升，地衣芽孢杆菌的生长状态不断上升。pH值超过8.0后，地衣芽孢杆菌的生长状态呈现下降趋势。最适pH值的范围为5.0～9.0，而当pH值大于11，生长状态几乎停止。地衣芽孢杆菌对酸碱的耐受性较高。由此可见，地衣芽孢杆菌对培养基要求不高，易于培养，这与刘岩[5]等的研究结果一致。
参考文献
[1]杨阳，张付云，苍桂璐，等.地衣芽胞杆菌生物活性物质应用研究进展[J].生物技术进展，2013，3（1）：22-26.
[2]曹煜成，李卓佳，冯娟，等.地衣芽孢杆菌胞外产物消化活性的研究[J].热带海洋学报，2005（6）：6-12.
[3]中华人民共和国农业部公告.[J].湖南饲料，2006（5）：5-6.
[4]廖智慧，陈志军，赵晓静，等.复合益生菌制剂应用现状及发展趋势[J].畜牧兽医科学（电子版），2019（2）：26-27.
[5]刘岩，仪淑敏，励建荣，等.地衣芽孢杆菌在营养肉汤中生长模型的建立[J].食品与生物技术学报，2014，33（10）：1025-1030.
基金项目：大学生创新训练计划201713573059X;动物药品创新与制备“创客”虚拟班（项目编号：2017ck008）
作者简介：丁康宁（1997-），女，本科生在读，研究方向：动物益生菌。
通信作者：张旭（1984-），男，河南商城人，实验师，研究方向：动物微生物和益生菌饲料添加剂。
关键词：地衣芽孢杆菌;营养肉汤;生长条件
中图分类号：TQ464 文献标识码：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.18.006
0 引言
地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）是一种常见的革兰氏阳性菌。该菌能产生多种生物活性物质，包括多糖、蛋白质、非肽类物质等，它们能促进饲料中营养素降解，提高饲料利用率[1]。此外地衣芽孢杆菌还能产生多种活性酶，这些酶可以促使细胞营养物质的释放，消除饲料中的抗营养物质[2]。在不良环境中，地衣芽孢杆菌可以形成芽孢，经受颗粒饲料加工和储存中一系列恶劣环境。因此，地衣芽孢杆菌被我国农业部2003年318号公告《饲料添加剂品种目录》批准使用为饲料级菌株[3]。
试验研究了地衣芽孢杆菌在营养肉汤培养基中不同温度、不同NaC1质量分数以及不同pH值条件下的生长特性，探索地衣芽孢杆菌的最优生长条件，可以为更好的筛选地衣芽孢杆菌益生菌，研发益生菌制剂提供依据。
1 材料
1.1 试剂
营养肉汤培养基、营养琼脂培养基为杭州百思生物科技有限公司产品。蛋白胨、牛肉浸膏、NaC1、HC1、NaOH、琼脂等为国药集团化学试剂有限公司产品。
1.2 试验菌株
地衣芽孢杆菌菌种为本实验室保存，分离于60日龄樱桃谷鸭的小肠。
2 方法
2.1 制备种子液
从保存菌种的斜面培养基上挑取菌落，接种于营养琼脂培养基，37℃培养24h。挑取扁平、边缘整齐、表面光滑、粘稠，呈乳白色的菌落，接种于营养肉汤培养基中，37℃培养24h。取该培养物，用无菌的生理盐水将其稀释至102～103cfu/mL，即为种子液。
2.2 平板菌落计数
在无菌操作下，将地衣芽孢杆菌待测样品10倍梯度稀释，吸取0.2mL不同稀释梯度的培养液均匀涂布在营养琼脂培养基上，每个梯度做2个平行，然后放置于培养箱中倒置培养。48h后记录每个平板中菌落数量，并且计算出菌落总数。
2.3 温度对地衣芽孢杆菌生长的影响
取7支相同规格试管，每支试管加入9.8mL营养肉汤培养基，121℃灭菌15min。待冷却后每支试管接种0.2mL种子液，分别置于10、15、20、25、30、37、45℃摇床中，180r/min振荡培养12h。每支试管各取1mL培养液，梯度稀释后进行平板菌落计数。
2.4 NaC1质量分数对地衣芽袍杆菌生长的影响
配制NaC1质量分数分别为0.5%、1%、3%、5%、7%、9%、12%的营养肉汤培养基。取7支相同规格试管，每个质量分数的营养肉汤培养基分别取9.8mL装于试管，121℃灭菌15min。待冷却后每支试管接种0.2mL种子液，置于37℃摇床中，180r/min荡培养24h。每支试管各取1mL培养液，梯度稀释后进行平板菌落计数。
2.5 pH值对地衣芽袍杆菌生长的影响
配制营养肉汤培养基，用1mol/L的HC1和1mol/L的NaOH将pH值分别调整为2、4、5、7、8、9、11。取7支相同规格试管，每个pH值营养肉汤培养基分别取9.8mL装于试管，121℃灭菌15min。待冷却后每支试管接种0.2mL种子液，置于37℃摇床中，180r/min振荡培养24h。每支试管各取1mL培养液，梯度稀释后进行平板菌落计数。
3 結果与分析
3.1 温度对地衣芽孢杆菌生长的影响
从10～37℃，地衣芽孢杆菌的生长状态呈现不断上升的趋势，而当37～45℃时，地衣芽孢杆菌的生长状态呈现下降趋势，见图1。其中在10～25℃范围内生长较为缓慢，在25～30℃范围中生长良好，最优生长温度为30～37℃;而当温度到达45℃左右，地衣芽孢杆菌的生长状态几乎停止。由此可知，地衣芽孢杆菌的最适生长温度为37℃，见表1。
3.2 NaCI质量分数对地衣芽孢杆菌生长的影响
地衣芽孢杆菌的生长状态随着NaC1质量分数的增高而呈现逐渐下降的趋势，见图2。NaC1质量分数在0.5%～3%间生长较为良好，在3%～7%，地衣芽孢杆菌的生长一般，在7%～12%生长状态不良。由此可知，地衣芽孢杆菌最适NaC1质量分数为1%，见表2。
3.3 pH值对地衣芽孢杆菌生长的影响
APH值2.0～8.0范围内，地衣芽孢杆菌的生长随着pH值的增大而呈现逐渐上升的趋势;而在PF3值为8.0～11.0范围内，其生长状态开始下降。其中在pH值为2.0～3.0，地衣芽孢杆菌基本不生长，pH值为4.0～5.0时生长逐渐开始增快，pH值在5.0～9.0范围内生长状态较好，pH为8.0时达到最大值。pH值大于9.0以后生长受到抑制，至pH值11.0时几乎停止生长。由此可知，地衣芽孢杆菌最适生长pH值为8.0。见图3、表3。
4 讨论
随着人们生活水平的提高和对健康的重视，益生菌作为绿色饲料添加剂越来越受到人们的青睐，益生菌的开发和应用必将对我国养殖业的发展起到积极作用[4]。地衣芽孢杆菌是一种安全、有效、抗逆性强、营养要求低的一种益生菌。试验讨论了营养肉汤培养基中不同的温度、NaC1质量分数、不同pH值条件对地衣芽孢杆菌生长状况的影响，便于我们对益生菌制剂的研发。
5 结论
随着温度的上升，地衣芽孢杆菌的生长状态不断上升，超过37℃后，地衣芽孢杆菌的生长状态呈现下降趋势。而当温度到达45℃左右，生长状态几乎停止。由此可知，地衣芽孢杆菌对温度的耐受性较高。随着NaC1质量分数增加，地衣芽孢杆菌的生长状态呈现下降趋势。NaC1质量分数在0一3%范围内生长最好，超过10%后，生长状态几乎停止。由此可知，地衣芽孢杆菌对NaC1的耐受性较高。随着pH值的上升，地衣芽孢杆菌的生长状态不断上升。pH值超过8.0后，地衣芽孢杆菌的生长状态呈现下降趋势。最适pH值的范围为5.0～9.0，而当pH值大于11，生长状态几乎停止。地衣芽孢杆菌对酸碱的耐受性较高。由此可见，地衣芽孢杆菌对培养基要求不高，易于培养，这与刘岩[5]等的研究结果一致。
参考文献
[1]杨阳，张付云，苍桂璐，等.地衣芽胞杆菌生物活性物质应用研究进展[J].生物技术进展，2013，3（1）：22-26.
[2]曹煜成，李卓佳，冯娟，等.地衣芽孢杆菌胞外产物消化活性的研究[J].热带海洋学报，2005（6）：6-12.
[3]中华人民共和国农业部公告.[J].湖南饲料，2006（5）：5-6.
[4]廖智慧，陈志军，赵晓静，等.复合益生菌制剂应用现状及发展趋势[J].畜牧兽医科学（电子版），2019（2）：26-27.
[5]刘岩，仪淑敏，励建荣，等.地衣芽孢杆菌在营养肉汤中生长模型的建立[J].食品与生物技术学报，2014，33（10）：1025-1030.
基金项目：大学生创新训练计划201713573059X;动物药品创新与制备“创客”虚拟班（项目编号：2017ck008）
作者简介：丁康宁（1997-），女，本科生在读，研究方向：动物益生菌。
通信作者：张旭（1984-），男，河南商城人，实验师，研究方向：动物微生物和益生菌饲料添加剂。