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摘要：目的丁胱亚磺酰亚胺排空组织谷胱甘肽对大鼠心肌c－iun、c-fosmRNA的影响。方法本实验设计三种实验模型，即力竭游泳运动模型、递增负荷游泳训练模型、BSO排空GSH模型，研究三种模型对大鼠心肌中原癌基因c-jun和c-fos mRNA表达的影响，结果发现：力竭运动后训练力竭组(TE)、注射BSO力竭组(BE)、对照力竭组(cE)的大鼠心肌中c-jun mRNA表达量与相对应的训练安静组(TR)、注射BSO(BR)、对照安静组(cR)均增加，其中力竭运动后BSO力竭组的c—jun mRNA表达量高于训练力竭组，c－jun mRNA表达量训练力竭组高于对照安静组。训练组、注射BSO组、对照组进行力竭游泳运动后，大鼠心肌中c-los安静组mRNA表达量增加。BSO力竭组的c-fos mRNA表达量高于对照力竭组。训练力竭组与对照力竭组相比c-fos mRNA表达量，没有明显变化。由上述实验结论得出，长时间力竭运动机体活性氧产生增加，c．jun mRNA和c-fos mRNA的表达量增加，进而激活转录因子AP-1。
关键词：力竭运动、递增负荷运动训练、谷胱甘肽、AP-1、c-fos、c—jun
中图分类号：G804．7 文献标识码：A 文章编号：1007—3612(2007)02—0200-03
本文依据文献推测，长时间力竭运动机体代谢旺盛的组织心肌活性氧产生增加，当其产生的量超出其还原能力时，势必对细胞的氧化还原状态产生影响，激活氧化还原敏感的转录因子AP一1的表达。本部分实验的研究目的：根据目前的大量的细胞实验研究结果提出种假设：长时间力竭运动产生的氧化应激有可能对原癌基因c—jun和c—fos的mRNA表达产生影响，进而激活转录因子AP一1，诱导某些特殊基因的转录。
1 研究对象与方向
1．1研究对象 实验选用纯系雄性Sprague—Dawley(SD)大鼠50只，体重200～250g，由上海医科大学实验动物中心提供，常规条件下采用分笼饲养，每笼5只，饲料选用国家标准啮齿类动物混合饲料喂养。室温控制在22℃±2℃，自由饮水进食。
1．2试剂与仪器ELISA检测大鼠TNF－a试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)异硫氰酸胍(Gibco公司)AMV逆转录酶(Promega公司)dNTPs(Promega公司)Oligo(dT)(Promega公司)Taq酶(华美公司)引物(赛百胜公司)DNA ladder(MBI公司)核酸蛋白分析仪(Beckman公司)核酸蛋白成像仪(Phar．macia公司)电泳仪及水平电泳槽(Bio—Rad公司)PCR仪(PE公司)
1．3 PCR引物设计
2 实验方法
2．1 实验动物分组、训练与处理 本实验模型参照Vebditti(1997)大鼠游泳训练模型。大鼠自购入后适应环境两天，然后在150 cm×60 cm×60 cm的玻璃水池中进行无负重游泳适应性训练一周，(水深45、水温维持在(33±2)℃)，15 min／次、5次／周。随机分成6组，即对照组(cR)、力竭组(CE)、训练组(TR)、训练力竭组(TE)、注射BSO组(BR)、注射BSO力竭组(BE)。
训练组进行10周渐增游泳训练，5次／周。第一周15min／次，第二周50 min／次，以后每周增加10 min直至第6周。第6～10周保持90 min／周。安静组和注射BSO组的大鼠常规条件下饲养。在游泳训练的最后8d，注射BSO组的大鼠开始注射BSO(L—Buthionine—Sulfoximine，丁胱亚磺酰亚胺)，一种谷氨酰半胱氨酸合酶(GCS)的抑制剂，采用腹腔注射。BSO的用量为：6 mmol／kg体重，用O．8～1．0 mL的生理盐水溶解，每天分别在8：00 AM～5：00 PM注射两次，对照组和训练组注射等量的生理盐水，共8d。
在最后一次训练后24h，先尾静脉取血，然后立即断头处死TR组的大鼠。在最后一次注药后30 min，大鼠尾静脉取血后，断头处死BR组的大鼠，安静状态，先尾静脉采血后断头处死CR组的大鼠。在力竭游泳后尾静脉采血，然后断头处死CE、TE、BE组的大鼠。处死后立即取大鼠的心肌放入液氮中保存。
2．2大鼠心肌的c—JunmRNA、c—FosmRNA的半定量测定
2．2．1 组织总RNA抽提及逆转录反应
2．2．2 采用紫外分光光度法，测定RNA样品在波长260 Flln和280 nm的紫外吸收值 根据10D260相当于40μg／mL RNA确定RNA的量，根据OD260／OD280光密度值定量判定RNA样品的纯度，并用电泳法鉴定其分子完整性。
2．2．3逆转录(总体积20 μL) Olig(dT)1μL，总RNA 2μg(根据OD260定量结果计算体积)H2O补足体积至12 uL，70℃反应10 min，立即至冰上逆转录体系包括：5×逆转录缓冲液(100 mM Tris—Hcl，500 mM KCl，1％Tritonx－100)4μL，0．1 mMDTT 2μL，10 mM dNTPs 1μL，AMV逆转录酶0．5μL，42℃反应50 min，75％反应10 min灭活逆转录酶。
2．2．4 PCR PCR反应组成如下：正向、反义链引物各2乩，25 mM MgCl2 1．6μL，10×扩增缓冲液2μL，10 mM dNTPs 0．5μL，逆转录产物2μL，Taq酶1μL，ddH2O补足20μL混匀，高速离心10s后加入20μL液体石蜡，防止蒸发并置于PCR仪上开始PCR反应，反应条件为：94℃预变性5 min；94℃30 s，55 ℃30 s，72℃30s，30个循环；72℃延伸7 min
2．2．5 电泳分析结果 配制1．8％的琼脂糖凝胶胶电泳，紫外灯下观察照片。
2．2．6结果计算 凝胶电泳结束后用凝胶成像系统拍照并进行电泳条带光密度分析。某标本靶基因条带光密度参数与内参基因(β—actin)条带的光密度参数之比值作为该标本mRNA的表达水平参数。
2．3统计学处理 实验数据采用SPSS软件包处理，进行方差分析和组间T检验。
3 结 果
3．1总RNA抽提结果用异硫氰酸胍／酚／氯仿一步抽提组织RNA经紫外分光光度计检测显示，260／280nm比值介于1．8～2．0之间，纯度符合要求。1％琼脂糖凝胶电泳总RNA鉴定见图1，28S荧光量度约为18S的1倍，无其它大分子条带，表明总RNA无蛋白污染，无降解。
3．2递增负荷训练、力竭运动及注射BSO后大鼠心肌c—JunmRNA表达的变化
3．3递增负荷训练、力竭运动及注射BSO后大鼠心肌c—Fos mRNA表达的变化
4 讨 论
本实验采用注射BSO排空组织GSH，心肌中的c—junmRNA和c—fos mRNA表达的量增加，进而激活转录因子AP－1。BSO、TNF—a均可诱导体内产生氧化应激及降低GSH的含量，改变细胞的氧化还原状态，从而激活转录因子AP-1和NF—kB，诱导某些特殊基因的表达。本实验结果也证明了此推论。其可能的机制为：BSO排空细胞内的GSH，细胞易受到活性氧的攻击，长时间力竭运动机体活性氧产生增加，TNF—a含量增加，细胞GSH／GSSG的比值变化的潜在可能性增加，氧化还原状态敏感的转录因子AP—1与DNA的结合活性增加，这可能部分由于在此过程中GSH在细胞核内的重新分布，核AP－1与DNA结合需保守的氧化状态敏感的半胱氨酸通过静电作用与锌原子形成“锌指结构”与DNA结合。氧化半胱氨酸可升高细胞内外的二硫键的含量，在这种情况下，半胱氨酸巯基可调节转录因子的立体结构或者半胱氨酸巯基可结合到蛋白的辅助因子上，位于蛋白序列的特殊位点上的4个胱氨酸和组氨酸与锌原子静电作用形成“锌指结构”适合DNA的大沟。由于巯基基团对氧化还原状态的敏感性，可调节转录因子的活性。通过非致命的氧化应激介导的细胞中不同的氧化还原状态短暂地改变，能调节一些转录因子的活性。调节作用有正调节和负调节，因此能上调或下调基因表达。
本实验另一结果显示：运动训练组c—jun mRNA的表达高于对照组，而训练组c—fos mRNA的表达与对照组没有明显变化。提示可能是由于随着时间运动时间的延长c—junmRNA不能完全降解，使其在细胞内累积，导致运动训练后c—jun mRNA的表达增加。因c—Fos蛋白和mRNA的半衰期短，运动训练24 h后，没有发现其mRNA表达的增加。可能由于AP－1的诱导作用受诱导反应时效较短的限制。AP－1总的DNA结合活性的增高，总伴随着AP-1复合物组分量的变化。如在受刺激后的较短时间内，c—Fos、FosB、c—Jun和JunB等成分的含量即有明显增加；这些亚单位数量上的变化引起的具体效应目前还不甚清楚。细胞c—Jun的表达量起着重要作用，在AP一1的组成成分中，c—Fos蛋白和mRNA的半衰期短于c—Jun蛋白及其mRNA，诱导前大多数AP－1的复合体是c—Jun同源或异源二聚体。诱导作用后，c—Fos蛋白表达量增加，大多数诱导的AP—1是从c—Fos和c—Jun的异源二聚体，c—Fos诱导作用可能是产生转录激活的峰值，c—Jun的激活作用是维持稳定AP－1的活性。
在诱导c—jun和c—fos的mRNA表达过程中，ROS可能是关键的诱导因素，此诱导过程还需要PLA2依赖的花生四烯酸的介导，然而花生四烯酸或者花生四烯酸与过氧化氢一起激活蛋白激酶c也需要c—fos mRNA的表达。
总之，在此相互作用的体系中，活性氧的产生是关键，TNF－a诱导c—jun和c—fos的基因表达，也是通过ROS的产生、含量增加。细胞因子的基因表达也可被氧化应激所诱导。长时间力竭运动，机体活性氧产生增加，以及TNF—a有增加的趋势，诱导原癌基因c—jun和c—fos的表达，从而激活转录因子AP－1，诱导某些基因的表达。
注：“本文中所涉及的注解、图表、公式等请以ＰＤＦ格式阅读原文。”
关键词：力竭运动、递增负荷运动训练、谷胱甘肽、AP-1、c-fos、c—jun
中图分类号：G804．7 文献标识码：A 文章编号：1007—3612(2007)02—0200-03
本文依据文献推测，长时间力竭运动机体代谢旺盛的组织心肌活性氧产生增加，当其产生的量超出其还原能力时，势必对细胞的氧化还原状态产生影响，激活氧化还原敏感的转录因子AP一1的表达。本部分实验的研究目的：根据目前的大量的细胞实验研究结果提出种假设：长时间力竭运动产生的氧化应激有可能对原癌基因c—jun和c—fos的mRNA表达产生影响，进而激活转录因子AP一1，诱导某些特殊基因的转录。
1 研究对象与方向
1．1研究对象 实验选用纯系雄性Sprague—Dawley(SD)大鼠50只，体重200～250g，由上海医科大学实验动物中心提供，常规条件下采用分笼饲养，每笼5只，饲料选用国家标准啮齿类动物混合饲料喂养。室温控制在22℃±2℃，自由饮水进食。
1．2试剂与仪器ELISA检测大鼠TNF－a试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)异硫氰酸胍(Gibco公司)AMV逆转录酶(Promega公司)dNTPs(Promega公司)Oligo(dT)(Promega公司)Taq酶(华美公司)引物(赛百胜公司)DNA ladder(MBI公司)核酸蛋白分析仪(Beckman公司)核酸蛋白成像仪(Phar．macia公司)电泳仪及水平电泳槽(Bio—Rad公司)PCR仪(PE公司)
1．3 PCR引物设计
2 实验方法
2．1 实验动物分组、训练与处理 本实验模型参照Vebditti(1997)大鼠游泳训练模型。大鼠自购入后适应环境两天，然后在150 cm×60 cm×60 cm的玻璃水池中进行无负重游泳适应性训练一周，(水深45、水温维持在(33±2)℃)，15 min／次、5次／周。随机分成6组，即对照组(cR)、力竭组(CE)、训练组(TR)、训练力竭组(TE)、注射BSO组(BR)、注射BSO力竭组(BE)。
训练组进行10周渐增游泳训练，5次／周。第一周15min／次，第二周50 min／次，以后每周增加10 min直至第6周。第6～10周保持90 min／周。安静组和注射BSO组的大鼠常规条件下饲养。在游泳训练的最后8d，注射BSO组的大鼠开始注射BSO(L—Buthionine—Sulfoximine，丁胱亚磺酰亚胺)，一种谷氨酰半胱氨酸合酶(GCS)的抑制剂，采用腹腔注射。BSO的用量为：6 mmol／kg体重，用O．8～1．0 mL的生理盐水溶解，每天分别在8：00 AM～5：00 PM注射两次，对照组和训练组注射等量的生理盐水，共8d。
在最后一次训练后24h，先尾静脉取血，然后立即断头处死TR组的大鼠。在最后一次注药后30 min，大鼠尾静脉取血后，断头处死BR组的大鼠，安静状态，先尾静脉采血后断头处死CR组的大鼠。在力竭游泳后尾静脉采血，然后断头处死CE、TE、BE组的大鼠。处死后立即取大鼠的心肌放入液氮中保存。
2．2大鼠心肌的c—JunmRNA、c—FosmRNA的半定量测定
2．2．1 组织总RNA抽提及逆转录反应
2．2．2 采用紫外分光光度法，测定RNA样品在波长260 Flln和280 nm的紫外吸收值 根据10D260相当于40μg／mL RNA确定RNA的量，根据OD260／OD280光密度值定量判定RNA样品的纯度，并用电泳法鉴定其分子完整性。
2．2．3逆转录(总体积20 μL) Olig(dT)1μL，总RNA 2μg(根据OD260定量结果计算体积)H2O补足体积至12 uL，70℃反应10 min，立即至冰上逆转录体系包括：5×逆转录缓冲液(100 mM Tris—Hcl，500 mM KCl，1％Tritonx－100)4μL，0．1 mMDTT 2μL，10 mM dNTPs 1μL，AMV逆转录酶0．5μL，42℃反应50 min，75％反应10 min灭活逆转录酶。
2．2．4 PCR PCR反应组成如下：正向、反义链引物各2乩，25 mM MgCl2 1．6μL，10×扩增缓冲液2μL，10 mM dNTPs 0．5μL，逆转录产物2μL，Taq酶1μL，ddH2O补足20μL混匀，高速离心10s后加入20μL液体石蜡，防止蒸发并置于PCR仪上开始PCR反应，反应条件为：94℃预变性5 min；94℃30 s，55 ℃30 s，72℃30s，30个循环；72℃延伸7 min
2．2．5 电泳分析结果 配制1．8％的琼脂糖凝胶胶电泳，紫外灯下观察照片。
2．2．6结果计算 凝胶电泳结束后用凝胶成像系统拍照并进行电泳条带光密度分析。某标本靶基因条带光密度参数与内参基因(β—actin)条带的光密度参数之比值作为该标本mRNA的表达水平参数。
2．3统计学处理 实验数据采用SPSS软件包处理，进行方差分析和组间T检验。
3 结 果
3．1总RNA抽提结果用异硫氰酸胍／酚／氯仿一步抽提组织RNA经紫外分光光度计检测显示，260／280nm比值介于1．8～2．0之间，纯度符合要求。1％琼脂糖凝胶电泳总RNA鉴定见图1，28S荧光量度约为18S的1倍，无其它大分子条带，表明总RNA无蛋白污染，无降解。
3．2递增负荷训练、力竭运动及注射BSO后大鼠心肌c—JunmRNA表达的变化
3．3递增负荷训练、力竭运动及注射BSO后大鼠心肌c—Fos mRNA表达的变化
4 讨 论
本实验采用注射BSO排空组织GSH，心肌中的c—junmRNA和c—fos mRNA表达的量增加，进而激活转录因子AP－1。BSO、TNF—a均可诱导体内产生氧化应激及降低GSH的含量，改变细胞的氧化还原状态，从而激活转录因子AP-1和NF—kB，诱导某些特殊基因的表达。本实验结果也证明了此推论。其可能的机制为：BSO排空细胞内的GSH，细胞易受到活性氧的攻击，长时间力竭运动机体活性氧产生增加，TNF—a含量增加，细胞GSH／GSSG的比值变化的潜在可能性增加，氧化还原状态敏感的转录因子AP—1与DNA的结合活性增加，这可能部分由于在此过程中GSH在细胞核内的重新分布，核AP－1与DNA结合需保守的氧化状态敏感的半胱氨酸通过静电作用与锌原子形成“锌指结构”与DNA结合。氧化半胱氨酸可升高细胞内外的二硫键的含量，在这种情况下，半胱氨酸巯基可调节转录因子的立体结构或者半胱氨酸巯基可结合到蛋白的辅助因子上，位于蛋白序列的特殊位点上的4个胱氨酸和组氨酸与锌原子静电作用形成“锌指结构”适合DNA的大沟。由于巯基基团对氧化还原状态的敏感性，可调节转录因子的活性。通过非致命的氧化应激介导的细胞中不同的氧化还原状态短暂地改变，能调节一些转录因子的活性。调节作用有正调节和负调节，因此能上调或下调基因表达。
本实验另一结果显示：运动训练组c—jun mRNA的表达高于对照组，而训练组c—fos mRNA的表达与对照组没有明显变化。提示可能是由于随着时间运动时间的延长c—junmRNA不能完全降解，使其在细胞内累积，导致运动训练后c—jun mRNA的表达增加。因c—Fos蛋白和mRNA的半衰期短，运动训练24 h后，没有发现其mRNA表达的增加。可能由于AP－1的诱导作用受诱导反应时效较短的限制。AP－1总的DNA结合活性的增高，总伴随着AP-1复合物组分量的变化。如在受刺激后的较短时间内，c—Fos、FosB、c—Jun和JunB等成分的含量即有明显增加；这些亚单位数量上的变化引起的具体效应目前还不甚清楚。细胞c—Jun的表达量起着重要作用，在AP一1的组成成分中，c—Fos蛋白和mRNA的半衰期短于c—Jun蛋白及其mRNA，诱导前大多数AP－1的复合体是c—Jun同源或异源二聚体。诱导作用后，c—Fos蛋白表达量增加，大多数诱导的AP—1是从c—Fos和c—Jun的异源二聚体，c—Fos诱导作用可能是产生转录激活的峰值，c—Jun的激活作用是维持稳定AP－1的活性。
在诱导c—jun和c—fos的mRNA表达过程中，ROS可能是关键的诱导因素，此诱导过程还需要PLA2依赖的花生四烯酸的介导，然而花生四烯酸或者花生四烯酸与过氧化氢一起激活蛋白激酶c也需要c—fos mRNA的表达。
总之，在此相互作用的体系中，活性氧的产生是关键，TNF－a诱导c—jun和c—fos的基因表达，也是通过ROS的产生、含量增加。细胞因子的基因表达也可被氧化应激所诱导。长时间力竭运动，机体活性氧产生增加，以及TNF—a有增加的趋势，诱导原癌基因c—jun和c—fos的表达，从而激活转录因子AP－1，诱导某些基因的表达。
注：“本文中所涉及的注解、图表、公式等请以ＰＤＦ格式阅读原文。”