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【摘 要】 目的：研究分析运用SNPscan高通量SNP分型技术对耳聋基因主要突变热点检测的临床价值。方法：随机抽取1278例耳聋患者为研究对象，用SNPscan高通量SNP分型技术对耳聋患者静脉血进行GJB2、SLC26A4和线粒体12SrRNA基因的主要突变热点的快速检测。结果：通过SNPscan技术与Sanger法测序技术的对比，两种方法检测出的结果一致；其中检测出174例携带者，占比13.62%；GJB2基因突变260例，占比20.34%；SLC26A4基因突变207例，占比16.20%；线粒体12SrRNA基因突变29例，占比2.27%。结论：SNPscan技术在耳聋基因主要突变热点检测中具有重要价值，为产前筛查、新生儿耳聋基因筛查、耳聋病因诊断和抗生素应用指导提供了实验室依据。
【关键词】 耳聋 SNPscan 基因检测
耳聋是在临床上是种常见的遗传病。根据2006年全国残疾人调查最新数据统计，我国聋哑者达2780万，且聋儿出生人数达3万左右/年，治疗康复费用巨大[1]。致聋的原因有很多，如环境因素、遗传因素或环境与遗传因素共同作用，其中遗传因素约占50%～60%[2]。SNPscan技术是在同一反应管内利用连接酶的高特异性进行连接反应，实现同时可检测出最少48个SNP位点，最多192个SNP位点等位基因的识别技术[3]。与“金标准”的Sanger法测序技术比较，SNPscan解决了Sanger法不能在耳聋基因的大规模普筛中对多个SNP位点进行检测的问题，SNPscan只要在一个反应管内就可以同时实现对多个SNP位点进行分型；此外，SNPscan具有快速高效、高自动化等优势，省去了Sanger法中一个SNP位点一次检测的繁琐操作，能快速、灵敏、准确的对SNP位点进行分型，且有研究证实SNPscan对突变位点的阳性检出率在98.9%以上[4]。通过SNPscan检测方法针对GJB2、SLC26A4和线粒体12SrRNA基因的主要突变热点设计探针，通过检测这些区域的SNP分型就可以判断是否是耳聋突变者。现随机抽取1278例耳聋患者，对其进行SNP分型的快速检测。
1 资料与方法
1.1 一般资料
从2012年1月到2014年12月在各医院治疗的耳聋患者中抽取1278例为研究对象。
1.2 检测方法
1.2.1 标本取材
抽取耳聋患者EDTA抗凝的静脉血2ml，首先用Qiagen公司的QIAampDNAMiniKit（Cat：51304）进行抽提；为了获得更纯的DNA样本，在进行蛋白酶消化的同时加入20ugRNaseA，最后洗脱时加入50ul洗脱液（10mMTris.Cl，pH8.0）洗脱，并将DNA浓度标定至50ng/ul。
1.2.2SNPscan检测
采用天昊生物医药科技（苏州）有限公司的先天性耳聋检测试剂盒。连接反应、连接产物多重荧光PCR扩增、扩增产物荧光毛细管电泳分离均参考试剂盒说明书。PCR扩增产物用美国ABI公司ABI3130XL进行毛细管电泳，原始数据文件采用GeneMapper4.1进行目标峰高的数据读取，进而对样本目的区域的SNP进行分型确定。
2 结果
从1278例耳聋患者EDTA抗凝的静脉血中抽提DNA，在2日内用SNPscan高通量SNP分型技术进行GJB2、SLC26A4和线粒体12SrRNA基因的主要突变热点的快速检测。其中检测出174例携带者，占比13.62%；GJB2基因突变260例，占比20.34%；SLC26A4基因突变207例，占比16.20%；线粒体12SrRNA基因突变29例，占比2.27%。与Sanger法测序技术的对比，两种方法检测出的结果完全一致（100%），见表1。
3 讨论
我国现有听障者2800万，占残疾人数的33%，位居各项残疾榜首。每年出生的新生儿中，有约占1～3‰为重度听力障碍者。先天性耳聋患者中遗传性耳聋占一半。临床上很多不明原因，由遗传因素引起的的后天性耳聋。遗传性耳聋大多属于感音神经性耳聋，无法根据临床表现确诊，且药物治疗效果不好。因此，通过高效准确的基因、产前诊断对遗传性耳聋能早发现、早治疗，从而降低发病率，是对遗传性耳聋实施临床干预的有重要意义。
线粒体12SrRNA基因突变的29例耳聋患者不能接触或使用氨基糖苷类抗生素，否则一旦形成药物性耳聋就很难治愈，尤其是病情较重、疗程较长的患者更难治愈。但对药物性耳聋也并非毫无办法、束手无策。可以采取些积极有效的治疗措施，有望使部分患者恢复少许听力。
SNPscan的检测原理：利用高特异性的连接酶进行连接反应实现对突变位点等位基因的识别，然后通过双连接反应（第一个连接：在连接探针末段引入不同长度的非特异序列；第二个连接：通过连接酶加接反应获得位点对应的不同长度连接产物），通过标记荧光的通用引物对连接产物进行PCR扩增，然后荧光毛细管电泳对扩增产物进行电泳分离，最后通过对ABI公司的GeneMapper软件分析获取各个SNP位点的基因型[3]。其探针稳定可以长时间保存，研究表明其具有高效、准确、灵敏、快速等优点，现被广泛应用在基因诊断研究领域。
4 结论
本次研究通过SNPscan技术对耳聋基因主要突变热点进行检测，由检测值与常规Sanger法测序技术对比分析结果一致。在检测出突变异常的496例患者中，GJB2基因突变异常的患者最多，有260例，占比20.34%，其次为SLC26A4基因突变207例，占比16.20%。与常规Sanger法测序技术检测相比，SNPscan技术在耳聋基因主要突变热点检测上具有实际临床应用价值，为产前筛查、新生儿耳聋基因筛查，耳聋病因诊断和抗生素应用指导提供依据与预防措施。
参考文献
[1]吕朵.BRAP基因rs3782886遗传变异和环境因素及其交互效应对代谢综合征的影响[D].浙江大学，2014.
[2]陈兴健，徐百成，陈迟，等.SNPscan法用于新疆主要少数民族非综合征型聋患者GJB2基因突变筛查的研究[J].听力学及言语疾病杂志，2014（6）：577-581.
【关键词】 耳聋 SNPscan 基因检测
耳聋是在临床上是种常见的遗传病。根据2006年全国残疾人调查最新数据统计，我国聋哑者达2780万，且聋儿出生人数达3万左右/年，治疗康复费用巨大[1]。致聋的原因有很多，如环境因素、遗传因素或环境与遗传因素共同作用，其中遗传因素约占50%～60%[2]。SNPscan技术是在同一反应管内利用连接酶的高特异性进行连接反应，实现同时可检测出最少48个SNP位点，最多192个SNP位点等位基因的识别技术[3]。与“金标准”的Sanger法测序技术比较，SNPscan解决了Sanger法不能在耳聋基因的大规模普筛中对多个SNP位点进行检测的问题，SNPscan只要在一个反应管内就可以同时实现对多个SNP位点进行分型；此外，SNPscan具有快速高效、高自动化等优势，省去了Sanger法中一个SNP位点一次检测的繁琐操作，能快速、灵敏、准确的对SNP位点进行分型，且有研究证实SNPscan对突变位点的阳性检出率在98.9%以上[4]。通过SNPscan检测方法针对GJB2、SLC26A4和线粒体12SrRNA基因的主要突变热点设计探针，通过检测这些区域的SNP分型就可以判断是否是耳聋突变者。现随机抽取1278例耳聋患者，对其进行SNP分型的快速检测。
1 资料与方法
1.1 一般资料
从2012年1月到2014年12月在各医院治疗的耳聋患者中抽取1278例为研究对象。
1.2 检测方法
1.2.1 标本取材
抽取耳聋患者EDTA抗凝的静脉血2ml，首先用Qiagen公司的QIAampDNAMiniKit（Cat：51304）进行抽提；为了获得更纯的DNA样本，在进行蛋白酶消化的同时加入20ugRNaseA，最后洗脱时加入50ul洗脱液（10mMTris.Cl，pH8.0）洗脱，并将DNA浓度标定至50ng/ul。
1.2.2SNPscan检测
采用天昊生物医药科技（苏州）有限公司的先天性耳聋检测试剂盒。连接反应、连接产物多重荧光PCR扩增、扩增产物荧光毛细管电泳分离均参考试剂盒说明书。PCR扩增产物用美国ABI公司ABI3130XL进行毛细管电泳，原始数据文件采用GeneMapper4.1进行目标峰高的数据读取，进而对样本目的区域的SNP进行分型确定。
2 结果
从1278例耳聋患者EDTA抗凝的静脉血中抽提DNA，在2日内用SNPscan高通量SNP分型技术进行GJB2、SLC26A4和线粒体12SrRNA基因的主要突变热点的快速检测。其中检测出174例携带者，占比13.62%；GJB2基因突变260例，占比20.34%；SLC26A4基因突变207例，占比16.20%；线粒体12SrRNA基因突变29例，占比2.27%。与Sanger法测序技术的对比，两种方法检测出的结果完全一致（100%），见表1。
3 讨论
我国现有听障者2800万，占残疾人数的33%，位居各项残疾榜首。每年出生的新生儿中，有约占1～3‰为重度听力障碍者。先天性耳聋患者中遗传性耳聋占一半。临床上很多不明原因，由遗传因素引起的的后天性耳聋。遗传性耳聋大多属于感音神经性耳聋，无法根据临床表现确诊，且药物治疗效果不好。因此，通过高效准确的基因、产前诊断对遗传性耳聋能早发现、早治疗，从而降低发病率，是对遗传性耳聋实施临床干预的有重要意义。
线粒体12SrRNA基因突变的29例耳聋患者不能接触或使用氨基糖苷类抗生素，否则一旦形成药物性耳聋就很难治愈，尤其是病情较重、疗程较长的患者更难治愈。但对药物性耳聋也并非毫无办法、束手无策。可以采取些积极有效的治疗措施，有望使部分患者恢复少许听力。
SNPscan的检测原理：利用高特异性的连接酶进行连接反应实现对突变位点等位基因的识别，然后通过双连接反应（第一个连接：在连接探针末段引入不同长度的非特异序列；第二个连接：通过连接酶加接反应获得位点对应的不同长度连接产物），通过标记荧光的通用引物对连接产物进行PCR扩增，然后荧光毛细管电泳对扩增产物进行电泳分离，最后通过对ABI公司的GeneMapper软件分析获取各个SNP位点的基因型[3]。其探针稳定可以长时间保存，研究表明其具有高效、准确、灵敏、快速等优点，现被广泛应用在基因诊断研究领域。
4 结论
本次研究通过SNPscan技术对耳聋基因主要突变热点进行检测，由检测值与常规Sanger法测序技术对比分析结果一致。在检测出突变异常的496例患者中，GJB2基因突变异常的患者最多，有260例，占比20.34%，其次为SLC26A4基因突变207例，占比16.20%。与常规Sanger法测序技术检测相比，SNPscan技术在耳聋基因主要突变热点检测上具有实际临床应用价值，为产前筛查、新生儿耳聋基因筛查，耳聋病因诊断和抗生素应用指导提供依据与预防措施。
参考文献
[1]吕朵.BRAP基因rs3782886遗传变异和环境因素及其交互效应对代谢综合征的影响[D].浙江大学，2014.
[2]陈兴健，徐百成，陈迟，等.SNPscan法用于新疆主要少数民族非综合征型聋患者GJB2基因突变筛查的研究[J].听力学及言语疾病杂志，2014（6）：577-581.