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[摘要]目的：研究重组人血管内皮生长因子（VEGF）基因对游离皮瓣、皮片及游离颗粒脂肪等移植物血管形成的作用。方法：将带有PCD-VEGF165的大肠杆菌接种到LB培养基中，通过碱分裂法制备PCD-VEGF165质粒，再用反蒸发法将质粒包埋于脂质体中。将108只雄性SD大鼠均分为三组，每组36只，每组再分三小组，分别为PCD-VEGF165目的基因组、PCD空白质粒组和生理盐水组，注入后在不同时间点取标本做成石蜡块行常规染色以观察血管生长情况。结果:三种移植组织中目的基因组微血管密度均显著高于其他两对照组（P<0.01），血管直径明显小于对照组（P<0.05），空白质粒组及生理盐水组差异无显著性意义（P＞0.05）。结论：VEGF基因生物活性稳定，特异性强，持续时间长。注射转VEGF基因的质粒后可诱导移植组织周围新血管的形成，增加血流灌注。
[关键词]血管内皮生长因子（VEGF)；血管形成；皮瓣；皮片；游离颗粒脂肪
[中图分类号]R813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2007）10-1325-03
Experimental study on the angiogenesis of rhVEGF gene to free transplanted tissue
LIU Jia-feng,ZHONG Wen-hui,ZHANG Yi-ming，YI Chuan-xun,ZHANG Jun,LIU Yu-lan,NIE Zhu-feng
（Department of Plastic Surgery,Union Hospital，Tongji Medical College,Huazhong Science & Technological University,Wuhan 430022,Hubei,China）
Abstract:ObjectiveTo investigate the angiogenesis of rhVEGF in the free transplanted tissues,such as flaps, grafts and free autologous pearl fat grafts in rats.MethodsThe plasmids with PCD-VEGF165 were made by alkalielysis method after the E.coli with PCD-VEGF165 was cultivated in the LB culture medium, and then the plasmid were buried in the liposome by reverse evaporation method. One hundred and eight Sprague-Dawley rats were divided into three groups: the flaps, the grafts andthe free fat. There were thirty six animals in each groups. And then all the groups were divided into three secondary groups: Injected with the plasmid cDNA encoding the 165-amino acid isoform of VEGF as the experiment group, the blank plasmid DNA as the negative control group and the normal saline as the frank control group. After injection the specimens were cut and harvested for pathological test. ResultsThe microvessel count in the PCD-VEGF165 groups were significantly higher than the other two control groups（P<0.01）.And the average vessel diameter of the PCD-VEGF group was finer than the other two control groups（P<0.05）. There were no significant difference in the blank PCD groups and the normal saline groups (P>0.05).ConclusionThe VEGF gene is stable ,special and enduring. And the angiogenesis and blood supply increased after it was injected in the free transplanted tissues.
Key words:vascular endothelial growth factor;angiogenesis;flap;graft;free pearl fat
自体组织移植的成活率一直是整形外科医生十分关注的问题之一，而提高成活率需要解决的核心问题是移植组织的血供问题，对移植组织的血供影响最大的是血管内皮生长因子（VEGF）,它能选择性地促进血管内皮细胞分裂[1-3]，在血管发生和形成中起到重要的调节作用[4]。但是VEGF价格昂贵、在体内不稳定、半衰期短的特点限制了它在临床的应用。而外源性VEGF基因通过质粒导入机体细胞后具有生物活性稳定、特异性强、持续时间长的特点，表达的VEGF可以分泌出细胞而发挥作用。我们应用分子生物学的方法在构建PCD-VEGF165重组质粒，并将之直接作用于皮瓣、皮片及游离颗粒脂肪的局部，探讨它对移植组织中血管形成的作用及其机制。
1材料和方法
1.1 主要试验材料：PCD-VEGF165由华中科技大学同济医学院分子生物学实验室惠赠。限制性内切酶BamH I、EcoR I购自Gibco公司。鼠抗人VEGF单克隆抗体，生物素标记的多克隆抗小鼠IgG抗体及CD34单克隆抗体均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。Sprague-Dawley大鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。
1.2 PCD-VEGF165质粒的制备：将含有PCD-VEGF165质粒的大肠杆菌菌种接种到LB培养基中，通过碱裂解法大量提取质粒。用聚乙二醇纯化所提取的质粒，紫外线分光光度计定量，以了解所提取质粒的浓度和纯度。取少量的质粒用BamHI,EcoRI双酶切鉴定，以检测目的基因和载体。用反向蒸发法制备脂质体包埋重组质粒，形成PCD-VEGF165脂质体复合物。
1.3 动物试验：将108只大鼠平均分成三组，每组36只，分别为：皮片组、皮瓣组和游离脂肪组。每组内再分为三小组，每小组12只，分别为： PCD-VEGF165试验组、PCD空白对照组和生理盐水对照组。
1.3.1皮片组：在大鼠背部两侧各作一3cm×2cm大小皮片，保留完整的皮下血管网，将含VEGF基因的脂质体100μg稀释成1000μl,10等份，每个皮片内选择均匀分布的5个点各注射100μl,受区皮下分5点各注射100μl,对照组同样方法各注射PCD及生理盐水1000μl，皮片左右交换位置后移植于对侧，缝合打包固定。术后24h处死动物4只，切取皮肤及皮下组织标本做成石蜡块，术后7天、14天分别取4只动物，处死动物切取标本，做成石蜡块。
1.3.2皮瓣组：以腹壁下动脉为中轴，设计并形成一5cm×2.5cm的皮瓣，将含VEGF基因的脂质体100μg稀释成1000μl,10等份，每个皮瓣内选择均匀分布的5个点各注射100μl,受区皮下分5点各注射100μl,对照组同样方法各注射PCD及生理盐水1000μl，止血，缝合皮肤切口。术后第4天麻醉后，显露大鼠腹壁下动静脉并结扎，缝合切口，术后12h处死动物4只，切取标本。术后7天、14天分别取4只动物，处死动物切取标本，做成石蜡块。
1.3.3 游离脂肪组：取腹股沟区脂肪0.2g，均匀剪成20小块，脂肪用生理盐水洗两次，剪碎，将100μg VEGF基因加生理盐水稀释成1ml，与剪碎的脂肪均匀混合，注射于皮肤与其下的肌肉之间。对照组同样方法以PCD及生理盐水1ml与脂肪混合注射。动物于第3天，第7天和第14天处死并分离出移植物，标本用10%福尔马林固定，常规制成石蜡切片。
1.4血管染色及计数方法：CD34单克隆抗体作为第一抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司产品），严格按照免疫组化SP法操作步骤进行，DAB显色后苏木素复染。每张切片在×100倍光镜下定位微血管CD34强烈表达的区域，然后于高倍视野（×400）中计数微血管数量，凡是染成棕色单个内皮细胞或内皮细胞簇集以及分叉的血管均作为一个血管计数，每张切片常规取3个视野，然后求其均值。
2结果
2.1 PCD-VEGF165重组质粒的鉴定：用碱裂法大量提取的质粒，经过聚乙二醇纯化后，用紫外分光光度计检测所提取质粒的纯度和浓度，根据公式：样品浓度=OD260×稀释倍数×50/1000，得出DNA样品的浓度为：10.5μg/μl,OD260/OD280=1.78，比值介于1.6与1.8之间,说明获取的DNA纯度高。PCD-VEGF165经BamH I 和EcoR I双酶切后，在1.7%琼脂糖凝胶上电泳，在5.4kb和600kb处出现两条带，分别为载体和目的基因。
2.2常规病理学检查结果分析
2.2.1 皮瓣组：标本经常规染色后进行血管计数，可见血管主要集中在真皮下，其中目的基因组的血管大部位管壁菲薄，且直径明显较对照组为小（ P<0.01）。目的基因组平均血管数较对照组多，且有显著性差异（P<0.01）,如表1所示。
2.2.2皮片组：标本经常规染色后，低倍显微镜下观察，实验组中皮下肉膜及肌肉中毛细血管密度明显高于对照组，且多为管径较小的新生毛细血管，目的基因组中血管密度与对照组相比有显著性差异（P<0.01），而管径却明显小于对照组（P<0.05），如表2所示。
2.2.3游离脂肪组:标本均存在被膜，纤维间隔。其中目的基因组的移植物纤维被膜及间隔较厚，由肉芽组织以及纤维组织所构成，新生血管丰富，有些血管呈垂直状向移植物延伸。脂肪组织结构完好，细胞分化成熟，空白质粒组和生理盐水组移植物被膜较菲薄，移植物内血管分布不均，边缘密集，中央较疏，镜下存在大量囊样脂池，坏死区。在各个时期不论被膜或移植脂肪组织中，目的基因组均较其他两组的血管密集，直径小，如表3所示。
3讨论
机体组织的缺损、畸形及创伤的修复往往需要采用各种类型的组织移植，所以活体组织移植是目前整形外科最常用的治疗手段之一，而组织移植成活的关键在于能否在受区建立稳定的血供关系。血供良好的受区可以为移植组织提供丰富的营养，保证移植物的成活。所以新生血管的形成是组织移植中的关键环节，如何促进血管的形成是目前研究的热点和难点。
血管内皮生长因子是迄今为止发现的促血管再生能力最强的生长因子，其中VEGF165在体内分布广泛，表达水平最高，是体内发挥生物学作用的主要形式，它与相应的受体结合后能刺激血管内皮细胞的增殖，形成血管[5]，已有学者将之应用于治疗下肢动脉闭塞性缺血及冠心病心肌缺血的治疗并取得良好的效果[6]，但是VEGF在体内的、不稳定且半衰期短的特点限制了它的临床应用，而外源性VEGF基因在载体的作用下进入细胞，具有生物活性稳定、特异性强、信息量大等优点，因此，我们以VEGF165的cDNA作为目的基因构建重组质粒PCD- VEGF165，并通过脂质体导入细胞而发挥作用。
以往的研究证明通过基因治疗可以促进血管生成，保证移植组织血供，促进损伤愈合[7]。本实验中免疫组化染色证明在目的基因组中VEGF的表达明显高于对照组（另文报道），说明外源性的基因通过载体的作用进入细胞后可以在局部表达丰富的外源性细胞因子，较对照组的因缺血而导致分泌的内源性细胞因子明显增多[8]。目的基因组的平均血管数较对照组明显多，而平均血管直径却小于对照组，均存在显著性差异。表明目的基因组局部高浓度的VEGF可以刺激血管内皮细胞增生，形成了较对照组更为丰富的血管，使缺血的组织血供得以改善，提高组织的成活率，体现在移植的皮瓣及皮片成活率增高，游离脂肪的吸收率减低。至于外源性基因是如何在局部发挥作用的，可能机制有：①VEGF目的基因的上游带有强启动子，可促进VEGF的表达；②局部组织缺血缺氧的刺激可使细胞表达内源性VEGF，缺氧使该因子的降解缓慢，半衰期延长，而这种内源性的细胞因子还可以放大少量外源性的细胞因子的效应[8]，导致VEGF在局部的蓄积而发挥作用；③VEGF与其受体之间存在正反馈，它可刺激血管内皮细胞VEGF受体的高表达，从而放大VEGF的效应。
我们的研究表明外源性的VEGF基因通过载体直接作用于局部可以在局部表达并刺激VEGF的分泌，后者可促进局部血管的增生，改善移植组织的血供，为组织提供充足的营养，从而促进组织的成活，预示着它在组织移植中美好的应用前景，但是要将该基因治疗的方法真正应用于临床，尚有不少问题需要解决。
[参考文献]
[1]Ferrara N,Houck K,Jakeman L,et al. Molecular and biological properties of the vascular endothelial growth factor family [J].Endocr Rev,1992,13:18-32.
[2]Ferrara N,Henzel WJ. Pituitary follicular cells secrete an over heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells[J]. Biochem Biophy Res Commun,1989,161:851-858.
[3]Connolly DT, Heuvelman DM, Neison R, et al. Tumor vascular permeability factor stimulates vascular cell growth and angiogenesis[J]. J Clin Invest,1989,84:1470-1478.
[4]彭晓燕,陈大年.血管内皮细胞生长因子和眼内新生血管[J].中华眼底病杂志.1999,15（1）:62.
[5]NJ Sait,M Dougher-vermazen,TB Show,et al.The kinase insert domain receptor gene(KDR) has been related to chromosome 4q11q12[J].Cytogenetcell Genet,1995,70:145-146.
[6]Inser JM, Rober AP, Richard B,et al.Clinical evidence of angiogenesis after arterial genetransfer of phVEGF165 in patient with ischemic limb Rev[J].Lancet,1996,348:370-374.
[7]易成刚,郭树忠. 基因治疗在整形外科的应用[J]. 中国美容医学,2003,12（3）:328-332.
[8]Namiki A,Brogi E,Keaney M,et al. Hypoxia induced vascular endothelial growth factor in cultured human endothelial cells[J].J Biol Chem.1995,270:31189-31195.
[收稿日期]2007-06-15 [修回日期]2007-09-11
编辑/张惠娟
[关键词]血管内皮生长因子（VEGF)；血管形成；皮瓣；皮片；游离颗粒脂肪
[中图分类号]R813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2007）10-1325-03
Experimental study on the angiogenesis of rhVEGF gene to free transplanted tissue
LIU Jia-feng,ZHONG Wen-hui,ZHANG Yi-ming，YI Chuan-xun,ZHANG Jun,LIU Yu-lan,NIE Zhu-feng
（Department of Plastic Surgery,Union Hospital，Tongji Medical College,Huazhong Science & Technological University,Wuhan 430022,Hubei,China）
Abstract:ObjectiveTo investigate the angiogenesis of rhVEGF in the free transplanted tissues,such as flaps, grafts and free autologous pearl fat grafts in rats.MethodsThe plasmids with PCD-VEGF165 were made by alkalielysis method after the E.coli with PCD-VEGF165 was cultivated in the LB culture medium, and then the plasmid were buried in the liposome by reverse evaporation method. One hundred and eight Sprague-Dawley rats were divided into three groups: the flaps, the grafts andthe free fat. There were thirty six animals in each groups. And then all the groups were divided into three secondary groups: Injected with the plasmid cDNA encoding the 165-amino acid isoform of VEGF as the experiment group, the blank plasmid DNA as the negative control group and the normal saline as the frank control group. After injection the specimens were cut and harvested for pathological test. ResultsThe microvessel count in the PCD-VEGF165 groups were significantly higher than the other two control groups（P<0.01）.And the average vessel diameter of the PCD-VEGF group was finer than the other two control groups（P<0.05）. There were no significant difference in the blank PCD groups and the normal saline groups (P>0.05).ConclusionThe VEGF gene is stable ,special and enduring. And the angiogenesis and blood supply increased after it was injected in the free transplanted tissues.
Key words:vascular endothelial growth factor;angiogenesis;flap;graft;free pearl fat
自体组织移植的成活率一直是整形外科医生十分关注的问题之一，而提高成活率需要解决的核心问题是移植组织的血供问题，对移植组织的血供影响最大的是血管内皮生长因子（VEGF）,它能选择性地促进血管内皮细胞分裂[1-3]，在血管发生和形成中起到重要的调节作用[4]。但是VEGF价格昂贵、在体内不稳定、半衰期短的特点限制了它在临床的应用。而外源性VEGF基因通过质粒导入机体细胞后具有生物活性稳定、特异性强、持续时间长的特点，表达的VEGF可以分泌出细胞而发挥作用。我们应用分子生物学的方法在构建PCD-VEGF165重组质粒，并将之直接作用于皮瓣、皮片及游离颗粒脂肪的局部，探讨它对移植组织中血管形成的作用及其机制。
1材料和方法
1.1 主要试验材料：PCD-VEGF165由华中科技大学同济医学院分子生物学实验室惠赠。限制性内切酶BamH I、EcoR I购自Gibco公司。鼠抗人VEGF单克隆抗体，生物素标记的多克隆抗小鼠IgG抗体及CD34单克隆抗体均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。Sprague-Dawley大鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。
1.2 PCD-VEGF165质粒的制备：将含有PCD-VEGF165质粒的大肠杆菌菌种接种到LB培养基中，通过碱裂解法大量提取质粒。用聚乙二醇纯化所提取的质粒，紫外线分光光度计定量，以了解所提取质粒的浓度和纯度。取少量的质粒用BamHI,EcoRI双酶切鉴定，以检测目的基因和载体。用反向蒸发法制备脂质体包埋重组质粒，形成PCD-VEGF165脂质体复合物。
1.3 动物试验：将108只大鼠平均分成三组，每组36只，分别为：皮片组、皮瓣组和游离脂肪组。每组内再分为三小组，每小组12只，分别为： PCD-VEGF165试验组、PCD空白对照组和生理盐水对照组。
1.3.1皮片组：在大鼠背部两侧各作一3cm×2cm大小皮片，保留完整的皮下血管网，将含VEGF基因的脂质体100μg稀释成1000μl,10等份，每个皮片内选择均匀分布的5个点各注射100μl,受区皮下分5点各注射100μl,对照组同样方法各注射PCD及生理盐水1000μl，皮片左右交换位置后移植于对侧，缝合打包固定。术后24h处死动物4只，切取皮肤及皮下组织标本做成石蜡块，术后7天、14天分别取4只动物，处死动物切取标本，做成石蜡块。
1.3.2皮瓣组：以腹壁下动脉为中轴，设计并形成一5cm×2.5cm的皮瓣，将含VEGF基因的脂质体100μg稀释成1000μl,10等份，每个皮瓣内选择均匀分布的5个点各注射100μl,受区皮下分5点各注射100μl,对照组同样方法各注射PCD及生理盐水1000μl，止血，缝合皮肤切口。术后第4天麻醉后，显露大鼠腹壁下动静脉并结扎，缝合切口，术后12h处死动物4只，切取标本。术后7天、14天分别取4只动物，处死动物切取标本，做成石蜡块。
1.3.3 游离脂肪组：取腹股沟区脂肪0.2g，均匀剪成20小块，脂肪用生理盐水洗两次，剪碎，将100μg VEGF基因加生理盐水稀释成1ml，与剪碎的脂肪均匀混合，注射于皮肤与其下的肌肉之间。对照组同样方法以PCD及生理盐水1ml与脂肪混合注射。动物于第3天，第7天和第14天处死并分离出移植物，标本用10%福尔马林固定，常规制成石蜡切片。
1.4血管染色及计数方法：CD34单克隆抗体作为第一抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司产品），严格按照免疫组化SP法操作步骤进行，DAB显色后苏木素复染。每张切片在×100倍光镜下定位微血管CD34强烈表达的区域，然后于高倍视野（×400）中计数微血管数量，凡是染成棕色单个内皮细胞或内皮细胞簇集以及分叉的血管均作为一个血管计数，每张切片常规取3个视野，然后求其均值。
2结果
2.1 PCD-VEGF165重组质粒的鉴定：用碱裂法大量提取的质粒，经过聚乙二醇纯化后，用紫外分光光度计检测所提取质粒的纯度和浓度，根据公式：样品浓度=OD260×稀释倍数×50/1000，得出DNA样品的浓度为：10.5μg/μl,OD260/OD280=1.78，比值介于1.6与1.8之间,说明获取的DNA纯度高。PCD-VEGF165经BamH I 和EcoR I双酶切后，在1.7%琼脂糖凝胶上电泳，在5.4kb和600kb处出现两条带，分别为载体和目的基因。
2.2常规病理学检查结果分析
2.2.1 皮瓣组：标本经常规染色后进行血管计数，可见血管主要集中在真皮下，其中目的基因组的血管大部位管壁菲薄，且直径明显较对照组为小（ P<0.01）。目的基因组平均血管数较对照组多，且有显著性差异（P<0.01）,如表1所示。
2.2.2皮片组：标本经常规染色后，低倍显微镜下观察，实验组中皮下肉膜及肌肉中毛细血管密度明显高于对照组，且多为管径较小的新生毛细血管，目的基因组中血管密度与对照组相比有显著性差异（P<0.01），而管径却明显小于对照组（P<0.05），如表2所示。
2.2.3游离脂肪组:标本均存在被膜，纤维间隔。其中目的基因组的移植物纤维被膜及间隔较厚，由肉芽组织以及纤维组织所构成，新生血管丰富，有些血管呈垂直状向移植物延伸。脂肪组织结构完好，细胞分化成熟，空白质粒组和生理盐水组移植物被膜较菲薄，移植物内血管分布不均，边缘密集，中央较疏，镜下存在大量囊样脂池，坏死区。在各个时期不论被膜或移植脂肪组织中，目的基因组均较其他两组的血管密集，直径小，如表3所示。
3讨论
机体组织的缺损、畸形及创伤的修复往往需要采用各种类型的组织移植，所以活体组织移植是目前整形外科最常用的治疗手段之一，而组织移植成活的关键在于能否在受区建立稳定的血供关系。血供良好的受区可以为移植组织提供丰富的营养，保证移植物的成活。所以新生血管的形成是组织移植中的关键环节，如何促进血管的形成是目前研究的热点和难点。
血管内皮生长因子是迄今为止发现的促血管再生能力最强的生长因子，其中VEGF165在体内分布广泛，表达水平最高，是体内发挥生物学作用的主要形式，它与相应的受体结合后能刺激血管内皮细胞的增殖，形成血管[5]，已有学者将之应用于治疗下肢动脉闭塞性缺血及冠心病心肌缺血的治疗并取得良好的效果[6]，但是VEGF在体内的、不稳定且半衰期短的特点限制了它的临床应用，而外源性VEGF基因在载体的作用下进入细胞，具有生物活性稳定、特异性强、信息量大等优点，因此，我们以VEGF165的cDNA作为目的基因构建重组质粒PCD- VEGF165，并通过脂质体导入细胞而发挥作用。
以往的研究证明通过基因治疗可以促进血管生成，保证移植组织血供，促进损伤愈合[7]。本实验中免疫组化染色证明在目的基因组中VEGF的表达明显高于对照组（另文报道），说明外源性的基因通过载体的作用进入细胞后可以在局部表达丰富的外源性细胞因子，较对照组的因缺血而导致分泌的内源性细胞因子明显增多[8]。目的基因组的平均血管数较对照组明显多，而平均血管直径却小于对照组，均存在显著性差异。表明目的基因组局部高浓度的VEGF可以刺激血管内皮细胞增生，形成了较对照组更为丰富的血管，使缺血的组织血供得以改善，提高组织的成活率，体现在移植的皮瓣及皮片成活率增高，游离脂肪的吸收率减低。至于外源性基因是如何在局部发挥作用的，可能机制有：①VEGF目的基因的上游带有强启动子，可促进VEGF的表达；②局部组织缺血缺氧的刺激可使细胞表达内源性VEGF，缺氧使该因子的降解缓慢，半衰期延长，而这种内源性的细胞因子还可以放大少量外源性的细胞因子的效应[8]，导致VEGF在局部的蓄积而发挥作用；③VEGF与其受体之间存在正反馈，它可刺激血管内皮细胞VEGF受体的高表达，从而放大VEGF的效应。
我们的研究表明外源性的VEGF基因通过载体直接作用于局部可以在局部表达并刺激VEGF的分泌，后者可促进局部血管的增生，改善移植组织的血供，为组织提供充足的营养，从而促进组织的成活，预示着它在组织移植中美好的应用前景，但是要将该基因治疗的方法真正应用于临床，尚有不少问题需要解决。
[参考文献]
[1]Ferrara N,Houck K,Jakeman L,et al. Molecular and biological properties of the vascular endothelial growth factor family [J].Endocr Rev,1992,13:18-32.
[2]Ferrara N,Henzel WJ. Pituitary follicular cells secrete an over heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells[J]. Biochem Biophy Res Commun,1989,161:851-858.
[3]Connolly DT, Heuvelman DM, Neison R, et al. Tumor vascular permeability factor stimulates vascular cell growth and angiogenesis[J]. J Clin Invest,1989,84:1470-1478.
[4]彭晓燕,陈大年.血管内皮细胞生长因子和眼内新生血管[J].中华眼底病杂志.1999,15（1）:62.
[5]NJ Sait,M Dougher-vermazen,TB Show,et al.The kinase insert domain receptor gene(KDR) has been related to chromosome 4q11q12[J].Cytogenetcell Genet,1995,70:145-146.
[6]Inser JM, Rober AP, Richard B,et al.Clinical evidence of angiogenesis after arterial genetransfer of phVEGF165 in patient with ischemic limb Rev[J].Lancet,1996,348:370-374.
[7]易成刚,郭树忠. 基因治疗在整形外科的应用[J]. 中国美容医学,2003,12（3）:328-332.
[8]Namiki A,Brogi E,Keaney M,et al. Hypoxia induced vascular endothelial growth factor in cultured human endothelial cells[J].J Biol Chem.1995,270:31189-31195.
[收稿日期]2007-06-15 [修回日期]2007-09-11
编辑/张惠娟