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【摘 要】 目的：建立在消栓颗粒剂中有效成份黄芪甲苷的HPLC-ELSD含量测定方法。方法：用Nanologica SVEA C18色谱柱（250mm×4.6mm，5m）采用HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷，蒸发光散射检测器（SEDEX-55型），柱温箱为25℃，流动相为乙腈∶[KG-*3/5]水（35∶[KG-*3/5]65），流速為1.0mL/min。结果：黄芪甲苷在0.2742～1.1492g内有良好的线性关系R=0.9994（n=6），平均回收率为99.16%，RSD为1.21%。结论：本方法操作简单快捷，结果准确可靠，重复性好，可用于消栓颗粒剂的质量控制。
【关键词】 黄芪甲苷;高效液相色谱法;蒸发光散射检测器;含量测定
【中图分类号】R284 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2021）1-0031-03
Determination of Astragaloside in Xiaoshuan Granules by HPLC
WANG Fayu1 WU Di2 ZHAO Fengming3 YUANJiaxin3
1.Beijing Pharmaceutical Group staff University， Beijing 100079，China;2.Baicheng food and Drug Inspection Institute， Baicheng 137000， China;
3.Jilin Aodong Deer Industry Co.， Ltd. Changchun 130021， China
Abstract：Objective To establish an HPLC-ELSD method for determining the effective component of astragaloside A in Xiaoshuan Granules. MethodNanologica SVEA C18 column （4.6mm×250mm， 5m） HPLC-ELSD determination of astragaloside， SEDEX-55 type evaporative light scattering detector， column temperature box is 25℃， mobile phase is acetonitrile： water （35∶[KG-*3/5]65 ）， Flow rate∶[KG-*3/5]1.0mL/ min. ResultsAstragaloside A is in the range of 0.2742～1.1492g， the linear relationship between the injection volume and the peak area integral value is good， the average recovery rate of R2 =0.9994 （n=6） is 99.16%， and the RSD is 1.21%.ConclusionThe method is simple， accurate， reliable and reproducible for the quality control of Xiaoshuan granule.
Keywords：Astragaloside A;HPLC;ELSD;Assay
消栓颗粒剂出自清朝名医王清任的《医林改错》卷下瘫痿论方[1]。该方特点为重用黄芪为君药，其黄芪用量是其它活血药总和的约3倍，方中重用的黄芪中含有多糖及黄芪甲苷[2-4]，同时黄芪还具有抗炎、增强免疫[5-6]、抗氧化[7]、保护心脏[8]、调脂[9]、降血糖[10]等作用。黄芪甲苷作为黄芪的主要有效成分，在我国药典中有含量测定并有相关含量限度规定[11]。本研究建立消栓颗粒剂中黄芪甲苷含量测定方法，进一步细化药品的质量控制。
1 仪器与试药
1.1 实验仪器 液相色谱仪（Agilent 1100） 检测器为四元泵二极管阵列，数据转换器为Agilent35900E蒸发散射检测器（SEDEX-55），单元泵（DXNamax-SD-200） ，AgII空气发生器电子天平（Mettler instrument Corp），超声波提取器（型号GT-350W型济宁科特超声电子有限公司）。
1.2 药品 消栓颗粒（ 自制的三批药品分别为20190905 20190904 20190902）自制的黄芪阴性对照;黄芪甲苷对照品（中检所110781201717）;乙腈（色谱纯）;其它试剂（分析纯）。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备 ①供试品溶液的制备：取本品7g，精密称定，加氨试液40mL移至具塞三角瓶中摇匀，密闭，过夜。取此提取液以40mL水饱和正丁醇萃取，共萃取3次后合并正丁醇萃取液，将其水浴蒸干，残渣以甲醇溶解后移至5mL容量瓶中，并稀释到刻度，然后取上清液，用滤膜过滤（0.45L），即得;②对照品溶液配制：称取黄芪甲苷对照品0.5mg加甲醇配制成每毫升含0.5mg的溶液;③阴性对照：按上述工艺配制缺黄芪的阴性对照品溶液。精密吸取上述①②③各10L测定。结果①和②在相同时间内出现相对应的色谱峰，而③则未出现。相关图谱如图1所示。
2.2 色谱条件 Nanologica SVEA C18色谱柱（250mm×4.6mm，5m）;以乙腈-水（35∶[KG-*3/5]65）为流动相;蒸发光散射检测器。1.0mL/min为流速，柱温为25℃，理论塔板数不低于4000，以黄芪甲苷峰计算。进样量为10L。 2.3 标准曲线与线性范围 黄芪甲苷对照品溶液（浓度为0.47mg/mL）精密吸取4～30L，进行测定峰的面积，纵坐标（Y）为峰面积log值，横坐标（X）为进样量log值，回归处理，结果显示黄芪甲苷在0.2742～1.1492g范围内，峰面积的积分值与进样量之间呈良好的线性关系，回归方程为Y=1.4709X+2.7033，R=0.9994（n=6）。
2.4 精密度试验 精密地吸取上述同一对照品溶液10L，在测试的条件和测试的地点相同的前提下，重复进样6次后测定黄芪甲苷的峰面积，并计算相对标准偏差，取6次RSD的平均值以记录。结果表明黄芪甲苷的平均峰面积为5527.88，RSD为1.45%，该方法精密度较好。
2.5 重复性试验 同批次的样品为供试品，按上文所述的方法配制供试品溶液，依上述方法重复进行含量平行测定。黄芪甲苷重复性试验结果的平均值为7919.53，RSD为1.63%。由以上可知，此方法的重复性良好。
2.6 稳定性实验 取本品供试品溶液，分别放置0～24h，每次吸取10L测定。结果平均峰面积为7519.55，RSD为1.87%。结果显示，供试品溶液在24h内稳定。
2.7 加样回收率 精密地称取已知含量的同一样品6份，其每份黄芪甲苷含量约1.25mg。精密地加入对照品溶液（含黄芪甲苷为1.2404mg）按以上样品测定项下的方法提取，测定含量并计算回收率，平均回收率为99.16%，RSD为1.21%，结果见表1。
2.8 检出限 取黄芪甲苷对照品配置成浓度为0.001mg/mL、0.002mg/mL、0.003mg/mL、0.004mg/mL、0.005mg/mL、0.006mg/mL、0.008mg/mL、0.01mg/mL的对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，进样量为10L，计算不同进样量的信噪比，经测定，浓度为0.005mg/mL的黄芪甲苷进样量为10L时，其信噪比为3，因此确定黄芪甲苷的最低检出限为0.05g。
2.9 样品含量测定 取10批次的上述样品，按供试品溶液的方法配制并测定其峰面积，再用外标两点法对数方程计算样品中黄芪甲苷的含量，测定结果见表2。考虑到每批药材之间质量差异和生产实际，最后将黄芪甲苷的含量定为不低于0.70mg/g。
3 讨论
黄芪为方中君药，其主要成分黄芪甲苷的含量测定可以做为控制消栓颗粒剂质量的指标性成份。本试验结果显示，黄芪甲苷平均加样回收率为 99.16%，RSD 为1.21%。样品中黃芪甲苷出峰时间为15.6min，且样品峰与其他峰的分离度很好。阴性对照试验表明，除黄芪外的其他原辅料不干扰样品中黄芪甲苷的含量测定。表明本结果准确，重复性良好，可用于对消栓颗粒剂的质量控制，从而保证临床应用中制剂的疗效和安全。
参考文献
[1]马培锋. 《医林改错》的学术价值[J]. 中国中医药现代远程教育，2018，16（7）：65-66，82.
[2]刘德丽，包华音，刘杨.近5年黄芪化学成分及药理作用研究进展[J]. 食品与药品，2014，16（1）：68-70.
[3]张秋海，丁家欣，李树莉，等. 不同生长年限黄芪中黄芪甲苷和多糖含量比较[J]. 中国中医药信息杂志，2014，21（11）：79-82.
[4]张峰，高鹏，彭俊华. 黄芪多糖及黄芪甲苷对巨噬细胞吞噬结核杆菌作用的研究[J]. 西北国防医学杂志，2005，26（6）：434-436.
[5] 王琳，闫晨. 玉屏风散中黄芪甲苷的制备及抗炎作用的研究[J]. 天津药学，2007，19（1）：31-32，55.
[6]杨志霞，王琦.黄芪多糖免疫作用的基础与临床研究进展[J]. 世界中医药，2013，8（7）：833-836
[7]肖文珍，桂定坤，陈廷芳，等. 黄芪甲苷的抗氧化应激作用对体外高糖刺激足细胞的保护作用[J]. 中国中西医结合肾病杂志，2013，14（5）：384-387.
[8]王焕珍，张惠鹏，赵东亮，等. 黄芪甲苷对肥大心肌细胞表面积及维生素D轴相关基因表达的影响[J]. 时珍国医国药，2018，29（4）：799-802.
[9]韩冬.黄芪甲苷对实验性糖尿病大鼠降糖、调脂和抗氧化作用的研究[J]. 现代中西医结合杂志， 2016，25（4）：360-364.
[10]尤良震，林逸轩，方朝晖，等. 黄芪甲苷治疗糖尿病及其并发症药理作用研究进展[J]. 中国中药杂志，2017，42（24）：4700-4706.
[11]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2015：302.
（收稿日期：2020-07-16 编辑：陶希睿）
【关键词】 黄芪甲苷;高效液相色谱法;蒸发光散射检测器;含量测定
【中图分类号】R284 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2021）1-0031-03
Determination of Astragaloside in Xiaoshuan Granules by HPLC
WANG Fayu1 WU Di2 ZHAO Fengming3 YUANJiaxin3
1.Beijing Pharmaceutical Group staff University， Beijing 100079，China;2.Baicheng food and Drug Inspection Institute， Baicheng 137000， China;
3.Jilin Aodong Deer Industry Co.， Ltd. Changchun 130021， China
Abstract：Objective To establish an HPLC-ELSD method for determining the effective component of astragaloside A in Xiaoshuan Granules. MethodNanologica SVEA C18 column （4.6mm×250mm， 5m） HPLC-ELSD determination of astragaloside， SEDEX-55 type evaporative light scattering detector， column temperature box is 25℃， mobile phase is acetonitrile： water （35∶[KG-*3/5]65 ）， Flow rate∶[KG-*3/5]1.0mL/ min. ResultsAstragaloside A is in the range of 0.2742～1.1492g， the linear relationship between the injection volume and the peak area integral value is good， the average recovery rate of R2 =0.9994 （n=6） is 99.16%， and the RSD is 1.21%.ConclusionThe method is simple， accurate， reliable and reproducible for the quality control of Xiaoshuan granule.
Keywords：Astragaloside A;HPLC;ELSD;Assay
消栓颗粒剂出自清朝名医王清任的《医林改错》卷下瘫痿论方[1]。该方特点为重用黄芪为君药，其黄芪用量是其它活血药总和的约3倍，方中重用的黄芪中含有多糖及黄芪甲苷[2-4]，同时黄芪还具有抗炎、增强免疫[5-6]、抗氧化[7]、保护心脏[8]、调脂[9]、降血糖[10]等作用。黄芪甲苷作为黄芪的主要有效成分，在我国药典中有含量测定并有相关含量限度规定[11]。本研究建立消栓颗粒剂中黄芪甲苷含量测定方法，进一步细化药品的质量控制。
1 仪器与试药
1.1 实验仪器 液相色谱仪（Agilent 1100） 检测器为四元泵二极管阵列，数据转换器为Agilent35900E蒸发散射检测器（SEDEX-55），单元泵（DXNamax-SD-200） ，AgII空气发生器电子天平（Mettler instrument Corp），超声波提取器（型号GT-350W型济宁科特超声电子有限公司）。
1.2 药品 消栓颗粒（ 自制的三批药品分别为20190905 20190904 20190902）自制的黄芪阴性对照;黄芪甲苷对照品（中检所110781201717）;乙腈（色谱纯）;其它试剂（分析纯）。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备 ①供试品溶液的制备：取本品7g，精密称定，加氨试液40mL移至具塞三角瓶中摇匀，密闭，过夜。取此提取液以40mL水饱和正丁醇萃取，共萃取3次后合并正丁醇萃取液，将其水浴蒸干，残渣以甲醇溶解后移至5mL容量瓶中，并稀释到刻度，然后取上清液，用滤膜过滤（0.45L），即得;②对照品溶液配制：称取黄芪甲苷对照品0.5mg加甲醇配制成每毫升含0.5mg的溶液;③阴性对照：按上述工艺配制缺黄芪的阴性对照品溶液。精密吸取上述①②③各10L测定。结果①和②在相同时间内出现相对应的色谱峰，而③则未出现。相关图谱如图1所示。
2.2 色谱条件 Nanologica SVEA C18色谱柱（250mm×4.6mm，5m）;以乙腈-水（35∶[KG-*3/5]65）为流动相;蒸发光散射检测器。1.0mL/min为流速，柱温为25℃，理论塔板数不低于4000，以黄芪甲苷峰计算。进样量为10L。 2.3 标准曲线与线性范围 黄芪甲苷对照品溶液（浓度为0.47mg/mL）精密吸取4～30L，进行测定峰的面积，纵坐标（Y）为峰面积log值，横坐标（X）为进样量log值，回归处理，结果显示黄芪甲苷在0.2742～1.1492g范围内，峰面积的积分值与进样量之间呈良好的线性关系，回归方程为Y=1.4709X+2.7033，R=0.9994（n=6）。
2.4 精密度试验 精密地吸取上述同一对照品溶液10L，在测试的条件和测试的地点相同的前提下，重复进样6次后测定黄芪甲苷的峰面积，并计算相对标准偏差，取6次RSD的平均值以记录。结果表明黄芪甲苷的平均峰面积为5527.88，RSD为1.45%，该方法精密度较好。
2.5 重复性试验 同批次的样品为供试品，按上文所述的方法配制供试品溶液，依上述方法重复进行含量平行测定。黄芪甲苷重复性试验结果的平均值为7919.53，RSD为1.63%。由以上可知，此方法的重复性良好。
2.6 稳定性实验 取本品供试品溶液，分别放置0～24h，每次吸取10L测定。结果平均峰面积为7519.55，RSD为1.87%。结果显示，供试品溶液在24h内稳定。
2.7 加样回收率 精密地称取已知含量的同一样品6份，其每份黄芪甲苷含量约1.25mg。精密地加入对照品溶液（含黄芪甲苷为1.2404mg）按以上样品测定项下的方法提取，测定含量并计算回收率，平均回收率为99.16%，RSD为1.21%，结果见表1。
2.8 检出限 取黄芪甲苷对照品配置成浓度为0.001mg/mL、0.002mg/mL、0.003mg/mL、0.004mg/mL、0.005mg/mL、0.006mg/mL、0.008mg/mL、0.01mg/mL的对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，进样量为10L，计算不同进样量的信噪比，经测定，浓度为0.005mg/mL的黄芪甲苷进样量为10L时，其信噪比为3，因此确定黄芪甲苷的最低检出限为0.05g。
2.9 样品含量测定 取10批次的上述样品，按供试品溶液的方法配制并测定其峰面积，再用外标两点法对数方程计算样品中黄芪甲苷的含量，测定结果见表2。考虑到每批药材之间质量差异和生产实际，最后将黄芪甲苷的含量定为不低于0.70mg/g。
3 讨论
黄芪为方中君药，其主要成分黄芪甲苷的含量测定可以做为控制消栓颗粒剂质量的指标性成份。本试验结果显示，黄芪甲苷平均加样回收率为 99.16%，RSD 为1.21%。样品中黃芪甲苷出峰时间为15.6min，且样品峰与其他峰的分离度很好。阴性对照试验表明，除黄芪外的其他原辅料不干扰样品中黄芪甲苷的含量测定。表明本结果准确，重复性良好，可用于对消栓颗粒剂的质量控制，从而保证临床应用中制剂的疗效和安全。
参考文献
[1]马培锋. 《医林改错》的学术价值[J]. 中国中医药现代远程教育，2018，16（7）：65-66，82.
[2]刘德丽，包华音，刘杨.近5年黄芪化学成分及药理作用研究进展[J]. 食品与药品，2014，16（1）：68-70.
[3]张秋海，丁家欣，李树莉，等. 不同生长年限黄芪中黄芪甲苷和多糖含量比较[J]. 中国中医药信息杂志，2014，21（11）：79-82.
[4]张峰，高鹏，彭俊华. 黄芪多糖及黄芪甲苷对巨噬细胞吞噬结核杆菌作用的研究[J]. 西北国防医学杂志，2005，26（6）：434-436.
[5] 王琳，闫晨. 玉屏风散中黄芪甲苷的制备及抗炎作用的研究[J]. 天津药学，2007，19（1）：31-32，55.
[6]杨志霞，王琦.黄芪多糖免疫作用的基础与临床研究进展[J]. 世界中医药，2013，8（7）：833-836
[7]肖文珍，桂定坤，陈廷芳，等. 黄芪甲苷的抗氧化应激作用对体外高糖刺激足细胞的保护作用[J]. 中国中西医结合肾病杂志，2013，14（5）：384-387.
[8]王焕珍，张惠鹏，赵东亮，等. 黄芪甲苷对肥大心肌细胞表面积及维生素D轴相关基因表达的影响[J]. 时珍国医国药，2018，29（4）：799-802.
[9]韩冬.黄芪甲苷对实验性糖尿病大鼠降糖、调脂和抗氧化作用的研究[J]. 现代中西医结合杂志， 2016，25（4）：360-364.
[10]尤良震，林逸轩，方朝晖，等. 黄芪甲苷治疗糖尿病及其并发症药理作用研究进展[J]. 中国中药杂志，2017，42（24）：4700-4706.
[11]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2015：302.
（收稿日期：2020-07-16 编辑：陶希睿）