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摘要 为比较不同的外植体灭菌时间、培养基质等对金线兰离体组织丛生芽诱导、壮苗生根的影响，寻求最适合的培养方法，达到快速获得大量幼苗的目的，特进行了金线兰组织培养技术试验。结果表明，外植体的灭菌时间对诱导成功率有较大影响；QZ（MS 6-BA 10 mg/L 蔗糖30 g/L 椰子汁30 mL/L 琼脂7 g/L，pH值5.5～5.8）培养基较适合金线兰外植体的诱导；SG（添加花宝1号3 g/L 花宝2号0.5 g/L 蛋白胨2 g/L 活性炭0.8 g/L 土豆泥50 g/L 蔗糖20 g/L 琼脂5.5 g/L，pH值5.5～5.8）培养基较适合金线兰的生根培养。
关键词 金线兰；组织培养；外植体
中图分类号 S567.23 9 文獻标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）14-0045-01
Abstract To compare the influences of different explant sterilization time，culture medium on the shoot induction in vitro，rooting and tran-splantation of Anoectochilus roxburghii，find out the most suitable culture method，test was carried out.The results showed that the sterilization time of the explant had a great influence on the induction success rate.The QZ（MS 6 BA 10 mg/L sucrose 30 g/L coconut milk 30 mL/L agar 7 g/L，pH value is 5.5～5.8） culture medium was suitable for the induction of explants of Anoectochilus roxburghii.The SG（Huabaol 0.5 g/L peptone 2 g/L activated carbon 0.8 g/L mashed potato 50 g/L sucrose 20 g/L agar 5.5 g/L，pH value is 5.5～5.8） medium was suitable for the rooting culture of Anoectochilus roxburghii.
Key words Anoectochilus roxburghii；tissue culture；explants
金线兰[Anoectochilus roxburghii（Wall.） Lindl.]，属兰科作物，别称花叶开唇兰、金钱风、金线莲等。生于海拔50～1 600 m的常绿阔叶林下或沟谷阴湿处，产于中国、日本、泰国、老挝、越南、印度、不丹，尼泊尔、孟加拉国也有分布[1]。金线兰氨基酸组成成分含量、抗衰老活性微量元素的含量均高于国产和野生西洋参，是我国传统珍贵药材，素有“金草”“神药”“乌人参”“药王”等美称[2]。其全草味甘性平，具有清热凉血、解毒消肿、润肺止咳、祛风利湿等功效，用于咯血、咳嗽痰喘、小便涩痛、消渴、乳糜尿、小儿急惊风、对口疮、心脏病、毒蛇咬伤等。金线兰种子微小，由未成熟的胚及数层种皮细胞构成，自然萌发率和繁殖率低，市场上货源主要来自于野生采挖，产品一直处于供不应求的状况。近年来，随着对其药用价值认识的进一步提高、药效学和临床应用研究的深入，金线兰市场货源紧缺的状况更为严峻，野生资源不断遭到破坏性采挖，以致濒临灭绝。
本研究利用快繁技术，进行金线兰离体组织培养，旨在快速增殖金线兰植株，供市场药用及观赏之途，满足人们不断增长的多种需求，保护其野生种质资源，并实现规模化生产和持续开发利用[3]。
本课题选用健康、壮实的金线兰带芽茎段作为外植体，比较不同的外植体灭菌时间、培养基质、有机添加物、激素、培养环境等对其丛生芽诱导、增殖、分化、壮苗生根的影响，寻求最适合的培养方法，达到快速获得大量幼苗的目的。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选用健壮、无病虫害的金线兰植株。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体灭菌。切取健壮、无病虫害的金线兰植株茎段[4] 6～10 cm带芽，去除叶片叶鞘，用低浓度洗洁精水浸泡4～5 min，自来水冲洗30 min，在超净工作台上用75% 酒精浸泡30 s，放入1% NaClO（每100 mL消毒液加1～2滴吐温20）中消毒7、9、11 min，无菌水冲洗5～6次，置于灭菌滤纸上吸干表面水分待用。
1.2.2 茎段诱导培养。将消毒好的金线兰带芽茎段，切成2～3 cm长，基部向下接入JD（MS 6-BA 0.5 mg/L 蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L，pH值5.5～5.8）、ZZ（MS 6-BA 5 mg/L 蔗糖30 g/L 椰子汁30 mL/L，琼脂7 g/L，pH值5.5～5.8）、QZ（MS 6-BA 10 mg/L 蔗糖30 g/L 椰子汁30 mL/L 琼脂7 g/L，pH值5.5～5.8）、CM（花宝1号3 g/L 蛋白胨2 g/L 活性炭0.8 g/L 香蕉泥15 g/L 土豆泥50 g/L 蔗糖20 g/L 琼脂5.5 g/L，pH值5.5～5.8）等4种基本诱导培养基[5]，每种培养基10瓶，每瓶3个茎段，室温（26±2）℃黑暗培养30 d。
1.2.3 丛芽继代增殖。将诱导成功的金线兰小芽接入ZZ培养基中，置于室温（26±2）℃、光照（2 000 lx）8 h/d环境下培养30 d。 1.2.4 壮苗与生根培养。将健壮的金线兰无根幼苗（高约3 cm，具有3～4个节间）接入CM（花宝1号3 g/L 蛋白胨2 g/L 活性炭0.8 g/L 香蕉泥15 g/L 土豆泥50 g/L 蔗糖20 g/L 琼脂5.5 g/L，pH值5.5～5.8）、SG（添加花宝1号3 g/L 花宝2号0.5 g/L 蛋白胨2 g/L 活性炭0.8 g/L 土豆泥50 g/L 蔗糖20 g/L 琼脂5.5 g/L，pH值5.5～5.8）培养基中，每种培养基10瓶，每瓶10苗，置于室温（26±2）℃、光照（2 000 lx）10 h/d环境下培养15 d。
1.2.5 炼苗移栽。将经过壮苗生根培养的金线兰幼苗放入炼苗棚进行自然光照培养，30 d后选取高7～8 cm、茎基直径约2 mm、丛生根3条或以上的小苗洗净晾干，用育苗盘进行假植培养，在18～25 ℃、3层75%活动遮荫网自然光下培养。
2 结果与分析
2.1 不同外植体灭菌时间对污染率、萌发率和死亡的影响
外植体经过灭菌，培养30 d后，部分污染，部分萌发，部分死亡。由表1可知，10% NaClO消毒7 min时间较短，污染率较高；消毒9 min效果居中；消毒11 min时间较长，死亡率较高。因此，把握外植体的灭菌时间对诱导成功率有较大影响。
2.2 不同培养基对诱导率的影响
外植体经过培养30 d后，JD、ZZ、QZ、CM培养基上的外植体诱导率分别为50.6%、75.1%、82.3%、47.2%。QZ培养基上的外植体诱导率较高。因此，QZ培养基较适合金线兰外植体的诱导。
2.3 不同培养基对壮苗、生根培养的影响
幼苗接入2种培养基培养30 d后，由表2可知，SG培养基上的幼苗新生叶片数和生根条数较多，较为合适。因此，SG培养基较适合金线兰的生根培养。
3 结论与讨论
金线兰属阴性植物，喜凉温，应在组织培养过程中根据其特性进行合理的光温调控[6]，如在诱导期黑暗培养，有利芽体分化，继代增殖期弱光培养，减缓苗体老化，壮苗生根期加强光照，促进植株增粗。金线兰的快繁技术已经十分成熟，在今后的组织培养扩繁中，要根据选用的外植体品种、部位来选择相应的培养基种类和添加物，制定相应的培养方案，以期提高产量和质量，获得更大的效益，促进农户增收，帮助当地现代农业发展[7-8]。
4 参考文献
[1] 张金国.金线莲组培快繁技术研究进展[J].现代农业科技，2014（14）：68-69.
[2] 曾建军，李军，李晓红，等.金线莲增殖培养研究[J].井冈山大学学报（自然科学版），2013（3）：34-36.
[3] 李艳冬，叶红霞，陈丽萍.金线莲组培快繁技术体系的研究[J].江西农业学报，2013（4）：52-54.
[4] 张文珠，林德钦，李梅.花叶开唇兰组培工厂化育苗技术[EB/OL].[2017-03-20].http：//www.doc88.com/p-7522991153023.html.
[5] 江建铭，俞旭平，沈晓霞，等.金线莲组培快繁技术研究[J].时珍国医国药，2009（2）：408-410.
[6] 林海，郝慧敏.金线兰愈伤组织诱导的最佳激素配比[J].湖北农业科学，2011（12）：2568-2570.
[7] 杨红丽，胡靖锋，徐学忠，等.金线莲的组织培养与快速繁殖研究[J].西南农业学报，2013（6）：2485-2488.
[8] 范子南，肖华山，范曉红，等.金线莲的组织培养研究[J].福建师范大学学报（自然科学版），1997（2）：85-90.
关键词 金线兰；组织培养；外植体
中图分类号 S567.23 9 文獻标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）14-0045-01
Abstract To compare the influences of different explant sterilization time，culture medium on the shoot induction in vitro，rooting and tran-splantation of Anoectochilus roxburghii，find out the most suitable culture method，test was carried out.The results showed that the sterilization time of the explant had a great influence on the induction success rate.The QZ（MS 6 BA 10 mg/L sucrose 30 g/L coconut milk 30 mL/L agar 7 g/L，pH value is 5.5～5.8） culture medium was suitable for the induction of explants of Anoectochilus roxburghii.The SG（Huabaol 0.5 g/L peptone 2 g/L activated carbon 0.8 g/L mashed potato 50 g/L sucrose 20 g/L agar 5.5 g/L，pH value is 5.5～5.8） medium was suitable for the rooting culture of Anoectochilus roxburghii.
Key words Anoectochilus roxburghii；tissue culture；explants
金线兰[Anoectochilus roxburghii（Wall.） Lindl.]，属兰科作物，别称花叶开唇兰、金钱风、金线莲等。生于海拔50～1 600 m的常绿阔叶林下或沟谷阴湿处，产于中国、日本、泰国、老挝、越南、印度、不丹，尼泊尔、孟加拉国也有分布[1]。金线兰氨基酸组成成分含量、抗衰老活性微量元素的含量均高于国产和野生西洋参，是我国传统珍贵药材，素有“金草”“神药”“乌人参”“药王”等美称[2]。其全草味甘性平，具有清热凉血、解毒消肿、润肺止咳、祛风利湿等功效，用于咯血、咳嗽痰喘、小便涩痛、消渴、乳糜尿、小儿急惊风、对口疮、心脏病、毒蛇咬伤等。金线兰种子微小，由未成熟的胚及数层种皮细胞构成，自然萌发率和繁殖率低，市场上货源主要来自于野生采挖，产品一直处于供不应求的状况。近年来，随着对其药用价值认识的进一步提高、药效学和临床应用研究的深入，金线兰市场货源紧缺的状况更为严峻，野生资源不断遭到破坏性采挖，以致濒临灭绝。
本研究利用快繁技术，进行金线兰离体组织培养，旨在快速增殖金线兰植株，供市场药用及观赏之途，满足人们不断增长的多种需求，保护其野生种质资源，并实现规模化生产和持续开发利用[3]。
本课题选用健康、壮实的金线兰带芽茎段作为外植体，比较不同的外植体灭菌时间、培养基质、有机添加物、激素、培养环境等对其丛生芽诱导、增殖、分化、壮苗生根的影响，寻求最适合的培养方法，达到快速获得大量幼苗的目的。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选用健壮、无病虫害的金线兰植株。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体灭菌。切取健壮、无病虫害的金线兰植株茎段[4] 6～10 cm带芽，去除叶片叶鞘，用低浓度洗洁精水浸泡4～5 min，自来水冲洗30 min，在超净工作台上用75% 酒精浸泡30 s，放入1% NaClO（每100 mL消毒液加1～2滴吐温20）中消毒7、9、11 min，无菌水冲洗5～6次，置于灭菌滤纸上吸干表面水分待用。
1.2.2 茎段诱导培养。将消毒好的金线兰带芽茎段，切成2～3 cm长，基部向下接入JD（MS 6-BA 0.5 mg/L 蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L，pH值5.5～5.8）、ZZ（MS 6-BA 5 mg/L 蔗糖30 g/L 椰子汁30 mL/L，琼脂7 g/L，pH值5.5～5.8）、QZ（MS 6-BA 10 mg/L 蔗糖30 g/L 椰子汁30 mL/L 琼脂7 g/L，pH值5.5～5.8）、CM（花宝1号3 g/L 蛋白胨2 g/L 活性炭0.8 g/L 香蕉泥15 g/L 土豆泥50 g/L 蔗糖20 g/L 琼脂5.5 g/L，pH值5.5～5.8）等4种基本诱导培养基[5]，每种培养基10瓶，每瓶3个茎段，室温（26±2）℃黑暗培养30 d。
1.2.3 丛芽继代增殖。将诱导成功的金线兰小芽接入ZZ培养基中，置于室温（26±2）℃、光照（2 000 lx）8 h/d环境下培养30 d。 1.2.4 壮苗与生根培养。将健壮的金线兰无根幼苗（高约3 cm，具有3～4个节间）接入CM（花宝1号3 g/L 蛋白胨2 g/L 活性炭0.8 g/L 香蕉泥15 g/L 土豆泥50 g/L 蔗糖20 g/L 琼脂5.5 g/L，pH值5.5～5.8）、SG（添加花宝1号3 g/L 花宝2号0.5 g/L 蛋白胨2 g/L 活性炭0.8 g/L 土豆泥50 g/L 蔗糖20 g/L 琼脂5.5 g/L，pH值5.5～5.8）培养基中，每种培养基10瓶，每瓶10苗，置于室温（26±2）℃、光照（2 000 lx）10 h/d环境下培养15 d。
1.2.5 炼苗移栽。将经过壮苗生根培养的金线兰幼苗放入炼苗棚进行自然光照培养，30 d后选取高7～8 cm、茎基直径约2 mm、丛生根3条或以上的小苗洗净晾干，用育苗盘进行假植培养，在18～25 ℃、3层75%活动遮荫网自然光下培养。
2 结果与分析
2.1 不同外植体灭菌时间对污染率、萌发率和死亡的影响
外植体经过灭菌，培养30 d后，部分污染，部分萌发，部分死亡。由表1可知，10% NaClO消毒7 min时间较短，污染率较高；消毒9 min效果居中；消毒11 min时间较长，死亡率较高。因此，把握外植体的灭菌时间对诱导成功率有较大影响。
2.2 不同培养基对诱导率的影响
外植体经过培养30 d后，JD、ZZ、QZ、CM培养基上的外植体诱导率分别为50.6%、75.1%、82.3%、47.2%。QZ培养基上的外植体诱导率较高。因此，QZ培养基较适合金线兰外植体的诱导。
2.3 不同培养基对壮苗、生根培养的影响
幼苗接入2种培养基培养30 d后，由表2可知，SG培养基上的幼苗新生叶片数和生根条数较多，较为合适。因此，SG培养基较适合金线兰的生根培养。
3 结论与讨论
金线兰属阴性植物，喜凉温，应在组织培养过程中根据其特性进行合理的光温调控[6]，如在诱导期黑暗培养，有利芽体分化，继代增殖期弱光培养，减缓苗体老化，壮苗生根期加强光照，促进植株增粗。金线兰的快繁技术已经十分成熟，在今后的组织培养扩繁中，要根据选用的外植体品种、部位来选择相应的培养基种类和添加物，制定相应的培养方案，以期提高产量和质量，获得更大的效益，促进农户增收，帮助当地现代农业发展[7-8]。
4 参考文献
[1] 张金国.金线莲组培快繁技术研究进展[J].现代农业科技，2014（14）：68-69.
[2] 曾建军，李军，李晓红，等.金线莲增殖培养研究[J].井冈山大学学报（自然科学版），2013（3）：34-36.
[3] 李艳冬，叶红霞，陈丽萍.金线莲组培快繁技术体系的研究[J].江西农业学报，2013（4）：52-54.
[4] 张文珠，林德钦，李梅.花叶开唇兰组培工厂化育苗技术[EB/OL].[2017-03-20].http：//www.doc88.com/p-7522991153023.html.
[5] 江建铭，俞旭平，沈晓霞，等.金线莲组培快繁技术研究[J].时珍国医国药，2009（2）：408-410.
[6] 林海，郝慧敏.金线兰愈伤组织诱导的最佳激素配比[J].湖北农业科学，2011（12）：2568-2570.
[7] 杨红丽，胡靖锋，徐学忠，等.金线莲的组织培养与快速繁殖研究[J].西南农业学报，2013（6）：2485-2488.
[8] 范子南，肖华山，范曉红，等.金线莲的组织培养研究[J].福建师范大学学报（自然科学版），1997（2）：85-90.