【摘 要】
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VD3羟化酶(VD3 Hydroxylase,VDH)是一种P450单加氧酶,属于CYP107家族,能够催化维生素D3的25位羟基化.铁氧化还原蛋白(Ferredoxin,FDX)和铁氧化还原蛋白还原酶(Ferredoxin red
【机 构】
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中国药科大学生命科学与技术学院微生物学教研室,江苏南京,210009
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VD3羟化酶(VD3 Hydroxylase,VDH)是一种P450单加氧酶,属于CYP107家族,能够催化维生素D3的25位羟基化.铁氧化还原蛋白(Ferredoxin,FDX)和铁氧化还原蛋白还原酶(Ferredoxin reductase,FDR)是两个电子传递链蛋白,参与羟化反应中电子的传递.构建具有羟基化酶体系活性的重组大肠杆菌,为骨化醇类化合物的高效转化提供参考.分别构建重组质粒pETDuet-1-fdr-fdx及pACYCDuet-1-vdh,将两个相容性质粒同时转入大肠杆菌BI21(DE3)中.采用IPTG对重组大肠杆菌进行诱导,使其表达目的蛋白,利用SDS-PAGE检测其蛋白大小及可溶性.采用液体传代的方法研究质粒稳定性.酶切鉴定和测序证明重组质粒pETDuet-1-fdr-fdx及pACYC-Duet-1-vdh构建成功.SDS-PAGE结果显示目的蛋白大小与预期一致.重组大肠杆菌可以将阿法骨化醇和艾地骨化醇中间体(AD-M07)分别转化成骨化三醇和艾地骨化醇中间体(AD-M08),转化率分别为36.10％和22.87％,转化时间为12 h,比自养假诺卡氏菌缩短600％.重组大肠杆菌经传代50次,质粒稳定性达到92％以上,说明该重组大肠杆菌菌株稳定性较好.实验成功构建了具有羟基化酶体系活性的重组大肠杆菌,为高效转化阿法骨化醇和艾地骨化醇中间体(AD-M07)奠定了基础.
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