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摘 要：隔离子是真核生物基因组中的DNA调控元件，在转录调控和染色质高级结构调节中发挥了关键作用。本研究就如何进行快速、有效的进行隔离子鉴定进行了探索，通过建立以EFC克隆及双荧光素酶报告基因以等方法，在基因组上成功地鉴定出了有隔离子活性的DNA非编码序列。
关键词：隔离子；报告基因；EFC；点突变
引言
人类基因组含有约19，000个编码蛋白质的基因，只占到基因组1-2%[1]，而剩下的99%的基因中绝大多数被认为是调控这1%基因的。2003年，美国国家人类基因组研究所发起的DNA元件百科全书（Encyclopedia of DNA Elements，ENCODE）[2]项目表明，有大量的调节元件可以调控基因表达。科学家们希望通过解密非蛋白编码基因的调控指令，来找到理解和治疗疾病的新方式。
染色质隔离子是涉及真核生物核组织和转录调控的遗传元件，已被证实在转录调控和调节染色质高级结构中发挥重要作用。本研究就如何快速高效地从基因组开放区域筛选有功能活性的隔离子DNA元件做一探索，为加快下游基因调控研究提供方法学基础。
材料与方法
载体构建
本实验中主要用到1个载体，用于荧光素酶报告基因实验的载体pGL3-pEFC。此载体在pGL3-control的基础上用同源重组的方法把多克隆位点换成一段特定序列的“臂”。最后用无连接酶克隆方法（Enzyme-Free Cloning，EFC）[3]将所研究隔离子区域插入到此载体上。
亚克隆
EFC：分别用引物终浓度为0.5 μM的LF与RV、FW与LR两对，100-200 ng gDNA为模板，2×Pfu Master Mix（天根公司）进行扩增，产物采用胶纯化（Axygen公司）后1：1混合后退火。载体质粒用10 U ApaI（Thermo公司）酶切过夜，胶纯化后用T4 DNA聚合酶（Thermo公司）消化。4 ul退火产物与1 μl载体混合，室温放置5min后转化DH5α感受态，涂于LB培养基平板过夜。单克隆经过PCR与测序双重验证（图1）。
定点突变：1 μM引物与10 ng模板质粒，反应条件：预变性98℃，30s，变性98℃，10s；退火50-60℃ 1min，延伸72℃，6min，循环12次，保温50℃，1min，充分延伸72℃，30min（Q5? High-Fidelity DNA Polymerases，NEB公司）。反应完成后加入1 μl DpnI（Thermo公司）37℃孵育3h转化DH5α感受态细胞，涂于LB培养基平板过夜。单克隆经过测序验证。
图1 EFC克隆示意图：载体经酶切线性化和T4 DNA聚合酶处理后，可产生约20 bp粘性末端，PCR产物经退火同样可以产生与载体粘端互补的末端，两者在同一试管中即可形成环状DNA分子，无需连接酶。
荧光素酶报告基因
采用磷酸钙（碧云天公司）操作指南瞬时转染293T细胞，萤火虫酶质粒与海肾质粒的质量比为100：1，荧光素酶活性采用Dual-Glo? Luciferase Aaasy System（Promega公司）试剂盒，GloMax? 20/20 Single Tube Luminometer单管发光检测仪检测。
结果
为了筛选前期利用生物信息学预测的DNA区域是否能具有隔离子的作用，将这些DNA片段用EFC发克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-pEFC上，并转染到293T细胞中检验荧光素酶活性信号，同时把这些DNA片段中含有潜在的与CCCTC结合因子蛋白（CTCF）的核心序列做缺失突变（图2）。结果发现有3个DNA片段的独立存在都能显著地降低荧光素酶活性，突变后降低的荧光素酶活性又能够大部分的恢复，对荧光素酶活性的影响和CTCF相关，这些预示着这3个DNA片段是具有典型的隔离子功能。
图2 荧光素酶报告图：通过筛选发现，528-1、1000-4和803-1三个DNA片段荧光信号有明显降低（与对照pGL-pEFC相比），核心序列缺失后荧光信号又能恢复（左）。对此3个DNA片段单独统计分析，核心序列突变前后荧光信号均有显著性差异，P<0.005（右）。
讨论
为了提高实验效率，我们采用了EFC克隆方法，这种方法有几个优点适于高通量快速筛选。最重要的是阳性率高，操作适当阳性率接近于100%，比常用的TA克隆、双酶切效率更高。其次采用此方法克隆方向和位置精准可控并且操作简单，一管式一步反应非常适用于大规模克隆。另外，本研究采用的点突变方法是在QuickChangeTM的基础上做了改进[4-5]，极大的提高了突变成功率。通过以上两种方法的结合使用，再利用报告基因实验进行检测，可以极大的提高DNA活性功能元件如本文所涉及的隔离子的筛选。
参考文献
[1] Ezkurdia I1，Juan D2，Rodriguez JM3，et al.Multiple evidence strands suggest that there may be as few as 19，000 human protein-coding genes.Hum Mol Genet.2014，23：5866-5878.
[2] Dunham I，Kundaje A，Aldred SF，et al.An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.Nature.2012，489：57-74.
[3] de Jong RN，Dani?ls MA，Kaptein R，et al.Enzyme free cloning for high throughput gene cloning and expression.J Struct Funct Genomics.2006，7（3-4）：109-18.
[4] Huanting Liu，James H Naismith.An efficient one-step site-directed deletion，insertion，single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.BMC Biotechnology 2008，8：91.
[5] Lei Zheng，Ulrich Baumann，Jean-Louis Reymond.An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol.Nucleic Acids Research，2004，32（14）：e115.
（作者單位：四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室）
关键词：隔离子；报告基因；EFC；点突变
引言
人类基因组含有约19，000个编码蛋白质的基因，只占到基因组1-2%[1]，而剩下的99%的基因中绝大多数被认为是调控这1%基因的。2003年，美国国家人类基因组研究所发起的DNA元件百科全书（Encyclopedia of DNA Elements，ENCODE）[2]项目表明，有大量的调节元件可以调控基因表达。科学家们希望通过解密非蛋白编码基因的调控指令，来找到理解和治疗疾病的新方式。
染色质隔离子是涉及真核生物核组织和转录调控的遗传元件，已被证实在转录调控和调节染色质高级结构中发挥重要作用。本研究就如何快速高效地从基因组开放区域筛选有功能活性的隔离子DNA元件做一探索，为加快下游基因调控研究提供方法学基础。
材料与方法
载体构建
本实验中主要用到1个载体，用于荧光素酶报告基因实验的载体pGL3-pEFC。此载体在pGL3-control的基础上用同源重组的方法把多克隆位点换成一段特定序列的“臂”。最后用无连接酶克隆方法（Enzyme-Free Cloning，EFC）[3]将所研究隔离子区域插入到此载体上。
亚克隆
EFC：分别用引物终浓度为0.5 μM的LF与RV、FW与LR两对，100-200 ng gDNA为模板，2×Pfu Master Mix（天根公司）进行扩增，产物采用胶纯化（Axygen公司）后1：1混合后退火。载体质粒用10 U ApaI（Thermo公司）酶切过夜，胶纯化后用T4 DNA聚合酶（Thermo公司）消化。4 ul退火产物与1 μl载体混合，室温放置5min后转化DH5α感受态，涂于LB培养基平板过夜。单克隆经过PCR与测序双重验证（图1）。
定点突变：1 μM引物与10 ng模板质粒，反应条件：预变性98℃，30s，变性98℃，10s；退火50-60℃ 1min，延伸72℃，6min，循环12次，保温50℃，1min，充分延伸72℃，30min（Q5? High-Fidelity DNA Polymerases，NEB公司）。反应完成后加入1 μl DpnI（Thermo公司）37℃孵育3h转化DH5α感受态细胞，涂于LB培养基平板过夜。单克隆经过测序验证。
图1 EFC克隆示意图：载体经酶切线性化和T4 DNA聚合酶处理后，可产生约20 bp粘性末端，PCR产物经退火同样可以产生与载体粘端互补的末端，两者在同一试管中即可形成环状DNA分子，无需连接酶。
荧光素酶报告基因
采用磷酸钙（碧云天公司）操作指南瞬时转染293T细胞，萤火虫酶质粒与海肾质粒的质量比为100：1，荧光素酶活性采用Dual-Glo? Luciferase Aaasy System（Promega公司）试剂盒，GloMax? 20/20 Single Tube Luminometer单管发光检测仪检测。
结果
为了筛选前期利用生物信息学预测的DNA区域是否能具有隔离子的作用，将这些DNA片段用EFC发克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-pEFC上，并转染到293T细胞中检验荧光素酶活性信号，同时把这些DNA片段中含有潜在的与CCCTC结合因子蛋白（CTCF）的核心序列做缺失突变（图2）。结果发现有3个DNA片段的独立存在都能显著地降低荧光素酶活性，突变后降低的荧光素酶活性又能够大部分的恢复，对荧光素酶活性的影响和CTCF相关，这些预示着这3个DNA片段是具有典型的隔离子功能。
图2 荧光素酶报告图：通过筛选发现，528-1、1000-4和803-1三个DNA片段荧光信号有明显降低（与对照pGL-pEFC相比），核心序列缺失后荧光信号又能恢复（左）。对此3个DNA片段单独统计分析，核心序列突变前后荧光信号均有显著性差异，P<0.005（右）。
讨论
为了提高实验效率，我们采用了EFC克隆方法，这种方法有几个优点适于高通量快速筛选。最重要的是阳性率高，操作适当阳性率接近于100%，比常用的TA克隆、双酶切效率更高。其次采用此方法克隆方向和位置精准可控并且操作简单，一管式一步反应非常适用于大规模克隆。另外，本研究采用的点突变方法是在QuickChangeTM的基础上做了改进[4-5]，极大的提高了突变成功率。通过以上两种方法的结合使用，再利用报告基因实验进行检测，可以极大的提高DNA活性功能元件如本文所涉及的隔离子的筛选。
参考文献
[1] Ezkurdia I1，Juan D2，Rodriguez JM3，et al.Multiple evidence strands suggest that there may be as few as 19，000 human protein-coding genes.Hum Mol Genet.2014，23：5866-5878.
[2] Dunham I，Kundaje A，Aldred SF，et al.An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.Nature.2012，489：57-74.
[3] de Jong RN，Dani?ls MA，Kaptein R，et al.Enzyme free cloning for high throughput gene cloning and expression.J Struct Funct Genomics.2006，7（3-4）：109-18.
[4] Huanting Liu，James H Naismith.An efficient one-step site-directed deletion，insertion，single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.BMC Biotechnology 2008，8：91.
[5] Lei Zheng，Ulrich Baumann，Jean-Louis Reymond.An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol.Nucleic Acids Research，2004，32（14）：e115.
（作者單位：四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室）