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【摘要】目的：建立颈脑康丸中黄芪甲苷的含量测定方法。方法：采用超声提取+柱纯化分离制备供试品溶液，HPLC-ELSD法测定，使用Agilent HC-C18 Analytical（5μm，46mm×250mm）色谱柱，以乙腈-水（36∶64）为流动相，流速为10 ml·min-1，漂移管温度70℃，氮气流量为28L·min-1。结果：黄芪甲苷在0032～032 mg·ml-1的范围内线性关系良好，其对数的线性方程为y=06615x-39805（r=09999），平均回收率为9677%，RSD=066%（n=6）。结论：本方法准确可靠，重现性好，结果稳定，可作为该制剂的质量控制。
【关键词】颈脑康丸;黄芪甲苷;HPLC-ELSD;含量测定
【中图分类号】R286【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2014）07-0018-02
Content Determination of Astragaloside IV in Jingnaokang Pill by HPLC-ELSDZhou Xiusen，Fang Yongkai
Xinyang Institute for Food and Drug Control，Xinyang 464000，ChinaAbstract： Object：To establish the method for the content determination of astragaloside IV in Jingnaokang Pill Methods：Using the technology of Ultrasonic Extraction and Solid-Phase Extraction to prepare Testing SolutionHPLC-ELSD method was carried on a column of Agilent HC-C18 Analytical column （5μm，46mm×250mm）with acetonitrile-water（36∶64）as mobile phase，drift tube temperature at 70 ℃，N2 flow being 28 L·min-1，and the flow rate being 10 ml·min-1 Results：There was a good linear relationship in the concent ration range of 0032～032 mg·ml-1，the linear equation is y=06615x-39805（r=09999）. The average recovery was 9677% ，with RSD=066%（n=6） Conclusion：This method is accurate，reliable，reproducible and stable，and can be applied to the quality control of the preparation.
Keywords：Jingnaokang Pill;Astragaloside IV;HPLC-DLSD;Content determination
頸脑康丸为河南省信阳市中医院制剂室配制的口服制剂，由黄芪、鸡血藤、丹参、地龙、葛根、威灵仙、红花等十三味中药组成。具有益气活血，痛经活络的功效，临床用于治疗颈椎病、脑梗塞、脑血管病后遗症及血管性脑供血不足等。该制剂中黄芪为君药，本文以黄芪甲苷为指标成分，参考有关文献[1-5]，建立高效液相色谱-蒸发光散射检测（HPLC-ELSD）法测定方中黄芪甲苷含量的方法，为该制剂的质量控制和评价提供依据。
1仪器与材料
11仪器Waters 1525高效液相色谱仪、Waters 2420 ELS检测器、Waters 2707自动进样器（美国Waters 公司）;METTLER AE-240电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）;KQ-300型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;基因型1850D超纯水机（重庆摩尔制水设备有限公司）。
12材料颈脑康丸（河南省信阳市中医院制剂室，批号：20130518，20130611，20130706）;黄芪甲苷对照品（批号：110781-200613，中国药品生物制品检定所）;色谱纯乙腈（河北四友卓越科技有限公司，批号：130615）;水为自制纯化水;其余试剂为分析纯。
2方法与结果
21色谱条件反相高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测，流动相为乙腈-水（36∶64），色谱柱为Agilent HC-C18 Analytical（5μm，46mm×250mm），流速为10 ml·min-1，漂移管温度为70℃，氮气流量为28L·min-1，柱温为25℃，进样体积为10μL，理论板数按黄芪甲苷峰计应不低于4000。
22溶液的制备
221对照品溶液精密称取置五氧化二磷减压干燥器中干燥12h以上的黄芪甲苷对照品1605mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取5ml，置50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（含黄芪甲苷01605mg·ml-1）。
222样品溶液[2-3]取本品10g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50ml，超声40min（功率300W， 频率50kHz），过滤，滤渣用甲醇洗涤2次（每次10ml），洗液并入滤液，滤液浓缩至干，残渣加水15ml，微热使溶解，通过D101型大孔吸附树脂（内径15cm，柱高12cm），依次用水100ml、1%氢氧化钠100ml、水200ml、30%乙醇100ml洗涤，弃去洗涤液，再用95%乙醇150ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。 223阴性对照溶液按处方比例和工艺制备不含黄芪的空白制剂样品，按222项下方法制备阴性对照溶液。
23方法学考察
231专属性试验取对照品溶液、样品溶液和阴性对照溶液，按“21项”下色谱条件实验，结果：样品溶液与对照品溶液一致，均在154min处出现黄芪甲苷峰，而阴性对照溶液在该位置处并没有峰出现，说明用本法处理样品制备供试液不产生假阳性干扰。色谱图见图1。
232线性关系在制备黄芪甲苷对照品溶液时，同时配制浓度为0032、008、016、024、032mg·ml-1的系列对照品溶液，分别按21项下色谱条件测定，以对照品溶液浓度的对数为纵坐标，峰面积值的对数为横坐标进行回归，线性回归方程为：y=06615x-39805（r=09999）。表明黄芪甲苷在0032～032 mg·ml-1的范围内线性关系良好。
233精密度试验取“221项”下配制的对照品溶液，重复进样5次，测得黄芪甲苷峰面积的平均值为63917， RSD=092%（n=5），表明仪器精密度良好。
234稳定性试验取同一制备样品溶液（批号20130518），分别在0、1、3、5、8h进样测定，测得峰面积的RSD=116%（n=5），表明样品溶液在8h内丹参素含量稳定。
235重复性试验取同批次样品（批号20130518），按“222项”下方法制备6份样品溶液，按“21项”下色谱条件分别测定，结果该批样品每10g中含黄芪甲苷的平均值为09129mg，RSD=171%（n=6），表明所用方法重复性好。
236加样回收率试验取已知准确含量的样品（批号20130518）5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50ml，再精密加入对照品溶液25ml，按“222项”下方法，平行制备6份供试液，依“21项”下色谱条件测定，计算加样回收率（%），结果见表1。试验结果表明，所采用的测定方法准确度高。
表1加样回收率试验结果（n=6）
取样量
（g）样品含有
量（mg）对照品加
入量（mg）测得总量
（mg）回收率
（%）平均回收
率（%）RSD
（%）503460459604012083829737
9677
066506710462604012083119621520490475204012085409744501170457504012083059672503260459404012082509586510530466104012084159703
24樣品含量测定取颈脑康丸3批，分别按“222项”下方法制备样品溶液，每批平行做3份，依“21项”下方法测定，计算出每10g中黄芪甲苷的平均含量，结果见表2。
表2样品含量测定结果
批号黄芪甲苷含量（mg/10g）123批平均含量
（mg/10g）总平均含量
（mg/10g）2013051809154090410919209129 2011061109016089270897908974090432013070609077090170898109025
3讨论
31样品溶液的制备采用超声提取和柱洗脱纯化分离的方法制备样品溶液。超声提取技术利用高频电磁波穿透提取介质，到达物料内部维管束和细胞，产生的电磁场还可加速被提取成分向提取溶剂界面扩散，最大限度保证提取的质量[2];提取液过滤后，通过D101树脂柱，经水、碱水、稀醇溶液洗涤纯化，乙醇洗脱，蒸干，甲醇溶解成供试品溶液。该方法提取效率高，操作简便，重现性好，避免了回流提取、水饱和正丁醇萃取分离的繁琐操作，缩短了检验流程，提高了工作效率，节省了人力物力。
32检测方法的选择黄芪甲苷在紫外光区属于末端吸收，吸收波长与所用溶剂甲醇的截止使用波长相近，受溶剂及其组分的影响，可靠性和灵敏度较低。参照中国药典2010年版一部[5]，采用通用性检测器-蒸发光散射检测器进行检测。
33含量限度的确定黄芪甲苷（即黄芪苷IV）为羊毛酯醇形的四环三萜皂苷，是中药黄芪的主要活性成分，在复方制剂中以黄芪为君药测定其黄芪甲苷含量作为质量评价指标是合理可行的;根据实验结果和处方中用量，拟定本品每10g含黄芪以黄芪甲苷（C41H68O14）计，不得少于08mg。
参考文献
[1]赵建邦，马潇.HPLC-ELSD测定补肺丸中黄芪甲苷的含量[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（14）：89-90.
[2] 李莉，谭蔚，马雪松.微波辅助提取黄芪甲苷的研究[J].中药材，2007，30（2）：234-236.
[3] 邢婕，秦雪梅，张丽增.HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷含量供试品溶液制备方法改进[J].山西大学学报（自然科学版），2008，31（4）：577-579.
[4] 周修森，方永凯.HPLC法测定柴丹疏利胶囊中丹参素的含量[J].西部中医药，2012，25（10）：25-27.
[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药出版社，2010：549.
（收稿日期：20140215）
【关键词】颈脑康丸;黄芪甲苷;HPLC-ELSD;含量测定
【中图分类号】R286【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2014）07-0018-02
Content Determination of Astragaloside IV in Jingnaokang Pill by HPLC-ELSDZhou Xiusen，Fang Yongkai
Xinyang Institute for Food and Drug Control，Xinyang 464000，ChinaAbstract： Object：To establish the method for the content determination of astragaloside IV in Jingnaokang Pill Methods：Using the technology of Ultrasonic Extraction and Solid-Phase Extraction to prepare Testing SolutionHPLC-ELSD method was carried on a column of Agilent HC-C18 Analytical column （5μm，46mm×250mm）with acetonitrile-water（36∶64）as mobile phase，drift tube temperature at 70 ℃，N2 flow being 28 L·min-1，and the flow rate being 10 ml·min-1 Results：There was a good linear relationship in the concent ration range of 0032～032 mg·ml-1，the linear equation is y=06615x-39805（r=09999）. The average recovery was 9677% ，with RSD=066%（n=6） Conclusion：This method is accurate，reliable，reproducible and stable，and can be applied to the quality control of the preparation.
Keywords：Jingnaokang Pill;Astragaloside IV;HPLC-DLSD;Content determination
頸脑康丸为河南省信阳市中医院制剂室配制的口服制剂，由黄芪、鸡血藤、丹参、地龙、葛根、威灵仙、红花等十三味中药组成。具有益气活血，痛经活络的功效，临床用于治疗颈椎病、脑梗塞、脑血管病后遗症及血管性脑供血不足等。该制剂中黄芪为君药，本文以黄芪甲苷为指标成分，参考有关文献[1-5]，建立高效液相色谱-蒸发光散射检测（HPLC-ELSD）法测定方中黄芪甲苷含量的方法，为该制剂的质量控制和评价提供依据。
1仪器与材料
11仪器Waters 1525高效液相色谱仪、Waters 2420 ELS检测器、Waters 2707自动进样器（美国Waters 公司）;METTLER AE-240电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）;KQ-300型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;基因型1850D超纯水机（重庆摩尔制水设备有限公司）。
12材料颈脑康丸（河南省信阳市中医院制剂室，批号：20130518，20130611，20130706）;黄芪甲苷对照品（批号：110781-200613，中国药品生物制品检定所）;色谱纯乙腈（河北四友卓越科技有限公司，批号：130615）;水为自制纯化水;其余试剂为分析纯。
2方法与结果
21色谱条件反相高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测，流动相为乙腈-水（36∶64），色谱柱为Agilent HC-C18 Analytical（5μm，46mm×250mm），流速为10 ml·min-1，漂移管温度为70℃，氮气流量为28L·min-1，柱温为25℃，进样体积为10μL，理论板数按黄芪甲苷峰计应不低于4000。
22溶液的制备
221对照品溶液精密称取置五氧化二磷减压干燥器中干燥12h以上的黄芪甲苷对照品1605mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取5ml，置50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（含黄芪甲苷01605mg·ml-1）。
222样品溶液[2-3]取本品10g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50ml，超声40min（功率300W， 频率50kHz），过滤，滤渣用甲醇洗涤2次（每次10ml），洗液并入滤液，滤液浓缩至干，残渣加水15ml，微热使溶解，通过D101型大孔吸附树脂（内径15cm，柱高12cm），依次用水100ml、1%氢氧化钠100ml、水200ml、30%乙醇100ml洗涤，弃去洗涤液，再用95%乙醇150ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。 223阴性对照溶液按处方比例和工艺制备不含黄芪的空白制剂样品，按222项下方法制备阴性对照溶液。
23方法学考察
231专属性试验取对照品溶液、样品溶液和阴性对照溶液，按“21项”下色谱条件实验，结果：样品溶液与对照品溶液一致，均在154min处出现黄芪甲苷峰，而阴性对照溶液在该位置处并没有峰出现，说明用本法处理样品制备供试液不产生假阳性干扰。色谱图见图1。
232线性关系在制备黄芪甲苷对照品溶液时，同时配制浓度为0032、008、016、024、032mg·ml-1的系列对照品溶液，分别按21项下色谱条件测定，以对照品溶液浓度的对数为纵坐标，峰面积值的对数为横坐标进行回归，线性回归方程为：y=06615x-39805（r=09999）。表明黄芪甲苷在0032～032 mg·ml-1的范围内线性关系良好。
233精密度试验取“221项”下配制的对照品溶液，重复进样5次，测得黄芪甲苷峰面积的平均值为63917， RSD=092%（n=5），表明仪器精密度良好。
234稳定性试验取同一制备样品溶液（批号20130518），分别在0、1、3、5、8h进样测定，测得峰面积的RSD=116%（n=5），表明样品溶液在8h内丹参素含量稳定。
235重复性试验取同批次样品（批号20130518），按“222项”下方法制备6份样品溶液，按“21项”下色谱条件分别测定，结果该批样品每10g中含黄芪甲苷的平均值为09129mg，RSD=171%（n=6），表明所用方法重复性好。
236加样回收率试验取已知准确含量的样品（批号20130518）5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50ml，再精密加入对照品溶液25ml，按“222项”下方法，平行制备6份供试液，依“21项”下色谱条件测定，计算加样回收率（%），结果见表1。试验结果表明，所采用的测定方法准确度高。
表1加样回收率试验结果（n=6）
取样量
（g）样品含有
量（mg）对照品加
入量（mg）测得总量
（mg）回收率
（%）平均回收
率（%）RSD
（%）503460459604012083829737
9677
066506710462604012083119621520490475204012085409744501170457504012083059672503260459404012082509586510530466104012084159703
24樣品含量测定取颈脑康丸3批，分别按“222项”下方法制备样品溶液，每批平行做3份，依“21项”下方法测定，计算出每10g中黄芪甲苷的平均含量，结果见表2。
表2样品含量测定结果
批号黄芪甲苷含量（mg/10g）123批平均含量
（mg/10g）总平均含量
（mg/10g）2013051809154090410919209129 2011061109016089270897908974090432013070609077090170898109025
3讨论
31样品溶液的制备采用超声提取和柱洗脱纯化分离的方法制备样品溶液。超声提取技术利用高频电磁波穿透提取介质，到达物料内部维管束和细胞，产生的电磁场还可加速被提取成分向提取溶剂界面扩散，最大限度保证提取的质量[2];提取液过滤后，通过D101树脂柱，经水、碱水、稀醇溶液洗涤纯化，乙醇洗脱，蒸干，甲醇溶解成供试品溶液。该方法提取效率高，操作简便，重现性好，避免了回流提取、水饱和正丁醇萃取分离的繁琐操作，缩短了检验流程，提高了工作效率，节省了人力物力。
32检测方法的选择黄芪甲苷在紫外光区属于末端吸收，吸收波长与所用溶剂甲醇的截止使用波长相近，受溶剂及其组分的影响，可靠性和灵敏度较低。参照中国药典2010年版一部[5]，采用通用性检测器-蒸发光散射检测器进行检测。
33含量限度的确定黄芪甲苷（即黄芪苷IV）为羊毛酯醇形的四环三萜皂苷，是中药黄芪的主要活性成分，在复方制剂中以黄芪为君药测定其黄芪甲苷含量作为质量评价指标是合理可行的;根据实验结果和处方中用量，拟定本品每10g含黄芪以黄芪甲苷（C41H68O14）计，不得少于08mg。
参考文献
[1]赵建邦，马潇.HPLC-ELSD测定补肺丸中黄芪甲苷的含量[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（14）：89-90.
[2] 李莉，谭蔚，马雪松.微波辅助提取黄芪甲苷的研究[J].中药材，2007，30（2）：234-236.
[3] 邢婕，秦雪梅，张丽增.HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷含量供试品溶液制备方法改进[J].山西大学学报（自然科学版），2008，31（4）：577-579.
[4] 周修森，方永凯.HPLC法测定柴丹疏利胶囊中丹参素的含量[J].西部中医药，2012，25（10）：25-27.
[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药出版社，2010：549.
（收稿日期：20140215）