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中圖分类号 R965.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）23-3205-05
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.23.07
摘 要 目的：研究刺山柑总生物碱对系统性硬皮病（SSc）模型小鼠Notch通路相关蛋白Notch2、Delta-like 3（DLL3）、Jagged1和Notch胞内段1（NICD1）的影响。方法：将BALB/c小鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组（青霉胺125 mg/kg）和刺山柑总生物碱低、中、高剂量组（225、450、900 mg/kg），每组16只。除空白对照组外，其余各组小鼠皮下注射博来霉素4周复制SSc模型，刺山柑总生物碱各剂量组小鼠外敷相应剂量的刺山柑总生物碱乳膏，阳性对照组小鼠灌胃相应剂量的青霉胺，空白对照组和模型组小鼠外敷不含药的乳膏基质，每天1次，连续给药8周。末次给药后4 h，取各组小鼠给药区皮肤，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）法检测皮肤组织中Notch2、NICD1 mRNA表达，酶联免疫吸附法测定皮肤组织中DLL3含量，免疫组化法检测皮肤组织中Jagged1蛋白表达。结果：与空白对照组比较，模型组小鼠皮肤组织中Notch2、NICD1 mRNA及DLL3含量、Jagged1蛋白表达均显著升高，差异均有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，刺山柑总生物碱中、高剂量组和阳性对照组小鼠皮肤组织中NICD1 mRNA、DLL3含量、Jagged1蛋白表达均显著降低，刺山柑总生物碱高剂量组和阳性对照组小鼠皮肤组织中Notch2 mRNA表达显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结论：刺山柑总生物碱可抑制SSc模型小鼠皮肤组织中Notch2、NICD1、DLL3及Jagged1的异常表达，对SSc模型小鼠Notch通路的过度激活有一定的抑制作用。
关键词 刺山柑总生物碱;系统性硬皮病;Notch2;Notch胞内段1;Delta-like 3;Jagged1;小鼠
Effects of Capparis spinosa Total Alkaloid on Notch Pathway in Mice with Systemic Sclerosis
LI Wei，LU Jun，Ayitila·Maimaitijiang，KANG Xiaolong（Dept. of Pharmacy， TCM Hospital of Affiliated to Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of Capparis spinosa total alkaloid on Notch pathways related protein Notch2， Delta-like 3 （DLL3）， Jagged1 and Notch intracellular domain 1 （NICD1） in mice with systemic sclerosis （SSc）. METHODS： BALB/c mice were randomly divided into blank control group， model group， positive control group （penicillamine 125 mg/kg）， C. spinosa total alkaloid low-dose， medium-dose and high-dose groups （225， 450， 900 mg/kg）， with 16 mice in each group. Except for blank control group， other groups were given bleomycin subcutaneously for 4 weeks to induce SSc model. C. spinosa total alkaloid groups were given relevant dose of C. spinosa total alkaloid cream for external use. Positive control group was given relevant dose of penicillamine intragastrically. Blank control group and model groups were given cream matrix without drug， once a day， for consecutive 8 weeks. 4 h after last administration， the skin of the administration area of each group of mice was collected. mRNA expression of Notch2 and NICD1 was detected by real-time PCR; the content of DLL3 was measured by ELISA; the protein expression of Jagged1 in skin tissue was detected by immunohistochemstry. RESULTS： Compared with blank control group， mRNA expression of Notch2 and NICD1， DLL3 content， protein expression of Jagged1 were markedly increased， with statistical significance （P<0.01）. Compared with model group， mRNA expression of NICD1， DLL3 content and protein expression of Jagged1 were decreased significantly in C. spinosa total alkaloid medium-dose and high-dose groups， positive control group， mRNA expression of Notch2 in skin tissue were decreased significantly in C. spinosa total alkaloid high-dose group and positive control group， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： C. spinosa total alkaloid can inhibit the abnormal expression of Notch2， NICD1， DLL3 and Jagged1 in skin tissue of SSc model mice， and inhibit over activation of Notch pathway in SSc model mice. KEYWORDS Capparis spinosa total alkaloid; Systemic sclerosis; Notch2; Notch intracellular domain 1; Delta-like 3; Jagged1; Mice
系统性硬皮病（Systemic sclerosis，SSc）病理表现为多组织、多器官纤维化，免疫系统失衡及血管异常[1]。刺山柑（Capparis spinosa L.）为白花菜科（Capparaceae）山柑属（Capparis Toum. ex L.）植物，系新疆道地药材之一。其性味辛苦温，具有祛风散寒、除湿、消肿止痛、扩张血管的功效。有研究表明，SSc患者Ⅰ型胶原的合成及成纤维细胞增殖可被刺山柑乙醇提取物抑制[2];硬皮病模型小鼠的胶原沉积、真皮增厚等病理改变可被刺山柑流浸膏抑制[3];刺山柑乙酸乙酯和乙醇提取物能抑制硬皮病模型小鼠真皮增厚及Ⅰ型胶原、转化生长因子β1过表达[4]。刺山柑总生物碱系本课题组从刺山柑中提取的有效部位，前期研究表明，给SSc模型小鼠外用刺山柑总生物碱乳膏后，小鼠皮肤纤维化等病理改变得到改善[5]，增厚的真皮鳞状上皮变薄，并可下调皮肤组织中羟脯氨酸及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达[6-7]，提示刺山柑总生物碱可抑制SSc的胶原合成、改善组织纤维化。刺山柑总生物碱乳膏已于2010年获得医院制剂批准文号：20050024HZ。本文以博来霉素复制SSc模型小鼠，研究刺山柑总生物碱对SSc模型小鼠皮肤组织纤维化密切相关的Notch通路相关蛋白Notch2、Delta-like 3（DLL3）、Jagged1和Notch胞内段1（NICD1）表达的影响，以为探讨刺山柑总生物碱改善SSc组织纤维化的作用机制提供参考。
1 材料
1.1 仪器
Multiskan Spectrum酶标仪、Multifuge X1R低温离心机（美国Thermo Fisher公司）;DFC360 FX显微镜、RM2245切片机（德国Leica公司）;C1000 Thermal Cycler实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）仪（美国Bio-Rad公司）。
1.2 药品与试剂
刺山柑原药材由新疆麦迪森维药饮片厂提供，由新疆药物研究所何江研究员鉴别为真品;注射用盐酸博来霉素（浙江海正辉瑞制药有限公司，批号：17001711，规格：15 mg）;青霉胺片（上海上药信谊药厂，批号：052160901，规格：0.125 g）;兔抗小鼠Jagged1抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（美国Cell Signaling Technology公司）;免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）;高纯总RNA快速提取试剂盒、SYBR real-time PCR试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）;小鼠DLL3酶联免疫试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）;二喹啉甲酸法（BCA法）蛋白定量试剂盒（江苏碧云天生物技术有限公司）;小鼠qPCR的Notch2、NICD1和内参Rn18s特异性引物（上海生物工程股份有限公司合成）。
1.3 动物
BALB/c小鼠96只，♀，SPF级，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。所有小鼠均在环境温度（24±1） ℃、相对湿度45%～65%、光照时间12 h的环境中饲养1周后进行实验，饲养期间小鼠自由进食标准饲料和饮水。本实验方案通过新疆医科大学附属中医医院动物实验伦理审查。
2 方法
2.1 刺山柑总生物碱提取物浓缩液的制备
将晒干粉碎的刺山柑果实，加10倍量95%乙醇80 ℃水浴回流提取30 min，提取2次，过滤，滤液备用，合并滤液，减压浓缩至药材与药液质量比为2 ∶ 1。提取物浓缩干燥后经紫外分光光度法测得总生物碱含量占提取物的32%（m/m），高效液相色谱法测得盐酸水苏碱含量占提取物的2.2%（m/m）。
2.2 刺山柑总生物碱乳膏的制备
以单硬脂酸甘油酯、白凡士林、月桂氮 酮、硬脂酸为油相，水浴加热至90 ℃使熔融;以刺山柑总生物碱提取物浓缩液与甘油混合物为水相，水浴加热至90 ℃;将羟基苯甲酸乙酯、十二烷基硫酸钠加入到适量水中，水浴加热使溶解作为乳化剂;把油相、水相自水浴中取出，温度降至85 ℃时，在油相中一边加入水相和乳化剂一边搅拌，直至乳化完全。该乳膏中刺山柑总生物碱的含量以盐酸水苏碱计，不得少于16 mg/g。
2.3 分组、造模与给药
96只BALB/c小鼠，采用随机数字表法分为空白对照组、模型组、阳性对照组（青霉胺125 mg/kg，根据临床用药量换算而得）[1，8]和刺山柑总生物碱低、中、高剂量组（225、450、900 mg/kg，分别为人临床用量的4.5、9、18倍），每组16只。剃除各组小鼠背部被毛，除空白对照组背部皮下注射生理盐水外，其余各组小鼠采用博来霉素皮下注射法[9-10]复制SSc模型，注射博来霉素30 μg/d，连续给药30 d，当小鼠背部注射部位均出现皮肤增厚、弹性变差等变化以及随机抽取各组1只小鼠，取皮肤组织做病理学检查显示出现炎症及纤维化等病变时，即造模成功。造模成功后，刺山柑总生物碱各剂量组小鼠外敷225、450、900 mg/kg的刺山柑总生物碱乳膏，阳性对照组小鼠灌胃给予125 mg/kg的青霉胺，空白对照组和模型组小鼠外敷不含刺山柑总生物碱的乳膏基质，每天给药1次，连续给药8周。
2.4 qPCR法检测皮肤组织中Notch2、NICD1 mRNA表达
末次给药后4 h处死小鼠，每组取5只小鼠背部注射处皮肤，置于冻存管，液氮迅速冷冻10 min，-80 ℃保存。采用高纯总RNA快速提取试剂盒提取皮肤组织总RNA，操作按试剂盒说明书进行，逆转录获到cDNA，设计Notch2、NICD1特异性引物，以Rn18s为内参，进行qPCR。反应条件：94 ℃预变性2 min;94 ℃变性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸95 s，35个循环;72 ℃最后延伸5 min。采用2-ΔΔct法分析Notch2、NICD1 mRNA的相對表达量，Δct=ct目标基因-ct内参基因，ΔΔct=Δct实验组-Δct对照组。qPCR引物序列见表1。 2.5 酶联免疫吸附法检测皮肤组织中DLL3含量
取各组15只处死小鼠背部皮肤，加入生理盐水，组织匀浆机研磨成组织匀浆，浓度为10%，4 000 r/min（离心半径8.3 cm）离心10 min后提取上清液。按小鼠DLL3酶联免疫试剂盒相关操作测定上清液中DLL3含量，并以每1 mL上清液中总蛋白含量（BCA法蛋白定量试剂盒测定）校正结果。
2.6 免疫组化法检测皮肤组织中Jagged1蛋白表达
各组取5只处死小鼠的背部注射区皮肤，4%多聚甲醛中固定、脱水、包埋、切片，脱蜡，放入柠檬酸钠液中，微波修复5 min，用3% H2O2封闭20 min，磷酸盐缓冲液冲洗，加入兔抗小鼠Jagged1抗体（1 ∶ 100稀释），4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗 （1 ∶ 100稀释），室温孵育1 h，二氨基联苯胺法（DAB）染色，苏木精复染。用显微镜摄片后输入计算机，Image Pro Plus 6.0专业图像分析软件对图片进行分析，调整图像分析软件在相同条件下计算积分光密度（IOD）和组织面积（area），再按公式计算平均光密度（MOD），MOD=IOD/area。各实验组MOD与空白对照组MOD的比值作为Jagged1的相对表达量。
2.7 统计学方法
采用 SPSS 11.0 软件进行统计分析。采用方差分析各组差异，SNK-q法分析两组间均数差异。P<0.05表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 皮肤组织中Notch2、NICD1 mRNA相对表达量比较
与空白对照组比较，模型组皮肤组织中Notch2、NICD1 mRNA相对表达量显著升高，差异均有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，刺山柑总生物碱高剂量组和阳性对照组小鼠皮肤组织中Notch2 mRNA相对表达量显著降低，刺山柑总生物碱中、高剂量组和阳性对照组小鼠皮肤组织中NICD1 mRNA相对表达量显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与阳性对照组比较，刺山柑总生物碱高剂量组小鼠皮肤组织中Notch2、NICD1 mRNA相对表达量无明显变化（P>0.05）。各组小鼠皮肤组织中Notch2、NICD1 mRNA相对表达量的结果见图1。
3.2 皮肤组织中DLL3含量比较
与空白对照组比较，模型组皮肤组织中DLL3含量显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，刺山柑总生物碱低、中、高剂量组和阳性对照组小鼠皮肤组织中DLL3含量显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与阳性对照组比较，刺山柑总生物碱中、高剂量组小鼠皮肤组织中DLL3含量无明显变化（P>0.05）。各组小鼠皮肤组织中DLL3含量测定结果见表2。
3.3 皮肤组织中Jagged1蛋白相对表达量比较
与空白对照组比较，模型组皮肤组织中Jagged1蛋白相对表达量显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，刺山柑总生物碱中、高剂量组和阳性对照组小鼠皮肤组织中Jagged1蛋白相对表达量显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与阳性对照组比较，刺山柑总生物碱高剂量组小鼠皮肤组织中Jagged1蛋白相对表达量无明显变化（P>0.05）。各组小鼠皮肤组织中Jagged1蛋白表达的免疫组化图见图2，相对表达量的结果见图3。
4 讨论
SSc是一种多组织呈现慢性炎症和纤维化的自身免疫性疾病，目前认为SSc病因是由于成纖维细胞活化，合成胶原、纤维连接蛋白等增多，造成细胞外基质沉积，引发组织纤维化[11-12]。目前，SSc的治疗缺乏明确有效的药物，多以免疫抑制、抗纤维化及对症治疗为主，青霉胺是目前临床上治疗系统性硬皮病较经典和常用的药物[1，8]，故本文选择青霉胺做为阳性对照药物。
Notch信号通路是一种进化上高度保守，广泛存在于多种组织细胞中的，对细胞的生长、发育、凋亡等发挥重要作用的信号通路[13]。Notch信号通路的异常激活参与了多种器官纤维化疾病，调节Notch信号通路可能对治疗纤维化疾病有一定作用[14]。哺乳动物Notch信号的受体有4种，分别是Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，而Notch的配体蛋白共有5种，分别是Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3和DLL4[15]。Notch受体与配体相互作用而激活，两者的结合导致受体构象发生改变，在解整合素金属蛋白酶（ADAM）蛋白酶的作用下，释放出NICD，NICD发生核转位，可激活影响细胞的分化、增殖和凋亡的基因如Hes和Hey等的转录[16-17]。
有研究提示，Notch信号通路参与了SSc纤维化的形成，发生纤维化的SSc患者皮肤组织和成纤维细胞的Notch通路被激活，Notch配体Jagged1过表达及NICD蓄积，可以导致SSc患者皮肤组织的纤维化，并可引起免疫功能紊乱和自身抗体的失衡[18-19];用次氯酸、博来霉素诱导的SSc模型鼠及紧皮鼠（Tsk-1鼠）皮肤和肺组织也发现了NICD表达增高[18];用Notch SiRNA抑制Notch表达可改善SSc小鼠皮肤增厚和纤维化[20]。Notch信号通路与SSc成纤维细胞活化相关，用重组的Jagged1可以刺激SSc成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，表达高水平的α-平滑肌肌动蛋白，产生大量的胶原和细胞外基质[19]。本研究结果发现，模型组小鼠皮肤组织中Notch2、NICD1 mRNA和DLL3含量、Jagged1蛋白表达升高，提示SSc模型小鼠存在Notch通路的异常激活;450、900 mg/kg的刺山柑总生物碱可明显降低Notch2、NICD1 mRNA和DLL3含量、Jagged1蛋白表达，提示刺山柑总生物碱可抑制Notch受体与配体的相互作用，抑制NICD蓄积及核转位，对SSc小鼠Notch通路的异常激活有一定抑制作用。 综上所述，刺山柑总生物碱可抑制SSc模型小鼠皮肤组织中Notch2、NICD1、DLL3及Jagged1的异常表达，结合本课题组前期研究结果：刺山柑总生物碱可改善SSc模型小鼠皮肤纤维化[5-7]，提示刺山柑总生物碱可能通过抑制Notch通路的异常激活，抑制胶原生成，降解细胞外基质，改善SSc皮肤纤维化。
参考文献
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（收稿日期：2019-07-30 修回日期：2019-10-11）
（編辑：邹丽娟）
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.23.07
摘 要 目的：研究刺山柑总生物碱对系统性硬皮病（SSc）模型小鼠Notch通路相关蛋白Notch2、Delta-like 3（DLL3）、Jagged1和Notch胞内段1（NICD1）的影响。方法：将BALB/c小鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组（青霉胺125 mg/kg）和刺山柑总生物碱低、中、高剂量组（225、450、900 mg/kg），每组16只。除空白对照组外，其余各组小鼠皮下注射博来霉素4周复制SSc模型，刺山柑总生物碱各剂量组小鼠外敷相应剂量的刺山柑总生物碱乳膏，阳性对照组小鼠灌胃相应剂量的青霉胺，空白对照组和模型组小鼠外敷不含药的乳膏基质，每天1次，连续给药8周。末次给药后4 h，取各组小鼠给药区皮肤，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）法检测皮肤组织中Notch2、NICD1 mRNA表达，酶联免疫吸附法测定皮肤组织中DLL3含量，免疫组化法检测皮肤组织中Jagged1蛋白表达。结果：与空白对照组比较，模型组小鼠皮肤组织中Notch2、NICD1 mRNA及DLL3含量、Jagged1蛋白表达均显著升高，差异均有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，刺山柑总生物碱中、高剂量组和阳性对照组小鼠皮肤组织中NICD1 mRNA、DLL3含量、Jagged1蛋白表达均显著降低，刺山柑总生物碱高剂量组和阳性对照组小鼠皮肤组织中Notch2 mRNA表达显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结论：刺山柑总生物碱可抑制SSc模型小鼠皮肤组织中Notch2、NICD1、DLL3及Jagged1的异常表达，对SSc模型小鼠Notch通路的过度激活有一定的抑制作用。
关键词 刺山柑总生物碱;系统性硬皮病;Notch2;Notch胞内段1;Delta-like 3;Jagged1;小鼠
Effects of Capparis spinosa Total Alkaloid on Notch Pathway in Mice with Systemic Sclerosis
LI Wei，LU Jun，Ayitila·Maimaitijiang，KANG Xiaolong（Dept. of Pharmacy， TCM Hospital of Affiliated to Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of Capparis spinosa total alkaloid on Notch pathways related protein Notch2， Delta-like 3 （DLL3）， Jagged1 and Notch intracellular domain 1 （NICD1） in mice with systemic sclerosis （SSc）. METHODS： BALB/c mice were randomly divided into blank control group， model group， positive control group （penicillamine 125 mg/kg）， C. spinosa total alkaloid low-dose， medium-dose and high-dose groups （225， 450， 900 mg/kg）， with 16 mice in each group. Except for blank control group， other groups were given bleomycin subcutaneously for 4 weeks to induce SSc model. C. spinosa total alkaloid groups were given relevant dose of C. spinosa total alkaloid cream for external use. Positive control group was given relevant dose of penicillamine intragastrically. Blank control group and model groups were given cream matrix without drug， once a day， for consecutive 8 weeks. 4 h after last administration， the skin of the administration area of each group of mice was collected. mRNA expression of Notch2 and NICD1 was detected by real-time PCR; the content of DLL3 was measured by ELISA; the protein expression of Jagged1 in skin tissue was detected by immunohistochemstry. RESULTS： Compared with blank control group， mRNA expression of Notch2 and NICD1， DLL3 content， protein expression of Jagged1 were markedly increased， with statistical significance （P<0.01）. Compared with model group， mRNA expression of NICD1， DLL3 content and protein expression of Jagged1 were decreased significantly in C. spinosa total alkaloid medium-dose and high-dose groups， positive control group， mRNA expression of Notch2 in skin tissue were decreased significantly in C. spinosa total alkaloid high-dose group and positive control group， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： C. spinosa total alkaloid can inhibit the abnormal expression of Notch2， NICD1， DLL3 and Jagged1 in skin tissue of SSc model mice， and inhibit over activation of Notch pathway in SSc model mice. KEYWORDS Capparis spinosa total alkaloid; Systemic sclerosis; Notch2; Notch intracellular domain 1; Delta-like 3; Jagged1; Mice
系统性硬皮病（Systemic sclerosis，SSc）病理表现为多组织、多器官纤维化，免疫系统失衡及血管异常[1]。刺山柑（Capparis spinosa L.）为白花菜科（Capparaceae）山柑属（Capparis Toum. ex L.）植物，系新疆道地药材之一。其性味辛苦温，具有祛风散寒、除湿、消肿止痛、扩张血管的功效。有研究表明，SSc患者Ⅰ型胶原的合成及成纤维细胞增殖可被刺山柑乙醇提取物抑制[2];硬皮病模型小鼠的胶原沉积、真皮增厚等病理改变可被刺山柑流浸膏抑制[3];刺山柑乙酸乙酯和乙醇提取物能抑制硬皮病模型小鼠真皮增厚及Ⅰ型胶原、转化生长因子β1过表达[4]。刺山柑总生物碱系本课题组从刺山柑中提取的有效部位，前期研究表明，给SSc模型小鼠外用刺山柑总生物碱乳膏后，小鼠皮肤纤维化等病理改变得到改善[5]，增厚的真皮鳞状上皮变薄，并可下调皮肤组织中羟脯氨酸及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达[6-7]，提示刺山柑总生物碱可抑制SSc的胶原合成、改善组织纤维化。刺山柑总生物碱乳膏已于2010年获得医院制剂批准文号：20050024HZ。本文以博来霉素复制SSc模型小鼠，研究刺山柑总生物碱对SSc模型小鼠皮肤组织纤维化密切相关的Notch通路相关蛋白Notch2、Delta-like 3（DLL3）、Jagged1和Notch胞内段1（NICD1）表达的影响，以为探讨刺山柑总生物碱改善SSc组织纤维化的作用机制提供参考。
1 材料
1.1 仪器
Multiskan Spectrum酶标仪、Multifuge X1R低温离心机（美国Thermo Fisher公司）;DFC360 FX显微镜、RM2245切片机（德国Leica公司）;C1000 Thermal Cycler实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）仪（美国Bio-Rad公司）。
1.2 药品与试剂
刺山柑原药材由新疆麦迪森维药饮片厂提供，由新疆药物研究所何江研究员鉴别为真品;注射用盐酸博来霉素（浙江海正辉瑞制药有限公司，批号：17001711，规格：15 mg）;青霉胺片（上海上药信谊药厂，批号：052160901，规格：0.125 g）;兔抗小鼠Jagged1抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（美国Cell Signaling Technology公司）;免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）;高纯总RNA快速提取试剂盒、SYBR real-time PCR试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）;小鼠DLL3酶联免疫试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）;二喹啉甲酸法（BCA法）蛋白定量试剂盒（江苏碧云天生物技术有限公司）;小鼠qPCR的Notch2、NICD1和内参Rn18s特异性引物（上海生物工程股份有限公司合成）。
1.3 动物
BALB/c小鼠96只，♀，SPF级，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。所有小鼠均在环境温度（24±1） ℃、相对湿度45%～65%、光照时间12 h的环境中饲养1周后进行实验，饲养期间小鼠自由进食标准饲料和饮水。本实验方案通过新疆医科大学附属中医医院动物实验伦理审查。
2 方法
2.1 刺山柑总生物碱提取物浓缩液的制备
将晒干粉碎的刺山柑果实，加10倍量95%乙醇80 ℃水浴回流提取30 min，提取2次，过滤，滤液备用，合并滤液，减压浓缩至药材与药液质量比为2 ∶ 1。提取物浓缩干燥后经紫外分光光度法测得总生物碱含量占提取物的32%（m/m），高效液相色谱法测得盐酸水苏碱含量占提取物的2.2%（m/m）。
2.2 刺山柑总生物碱乳膏的制备
以单硬脂酸甘油酯、白凡士林、月桂氮 酮、硬脂酸为油相，水浴加热至90 ℃使熔融;以刺山柑总生物碱提取物浓缩液与甘油混合物为水相，水浴加热至90 ℃;将羟基苯甲酸乙酯、十二烷基硫酸钠加入到适量水中，水浴加热使溶解作为乳化剂;把油相、水相自水浴中取出，温度降至85 ℃时，在油相中一边加入水相和乳化剂一边搅拌，直至乳化完全。该乳膏中刺山柑总生物碱的含量以盐酸水苏碱计，不得少于16 mg/g。
2.3 分组、造模与给药
96只BALB/c小鼠，采用随机数字表法分为空白对照组、模型组、阳性对照组（青霉胺125 mg/kg，根据临床用药量换算而得）[1，8]和刺山柑总生物碱低、中、高剂量组（225、450、900 mg/kg，分别为人临床用量的4.5、9、18倍），每组16只。剃除各组小鼠背部被毛，除空白对照组背部皮下注射生理盐水外，其余各组小鼠采用博来霉素皮下注射法[9-10]复制SSc模型，注射博来霉素30 μg/d，连续给药30 d，当小鼠背部注射部位均出现皮肤增厚、弹性变差等变化以及随机抽取各组1只小鼠，取皮肤组织做病理学检查显示出现炎症及纤维化等病变时，即造模成功。造模成功后，刺山柑总生物碱各剂量组小鼠外敷225、450、900 mg/kg的刺山柑总生物碱乳膏，阳性对照组小鼠灌胃给予125 mg/kg的青霉胺，空白对照组和模型组小鼠外敷不含刺山柑总生物碱的乳膏基质，每天给药1次，连续给药8周。
2.4 qPCR法检测皮肤组织中Notch2、NICD1 mRNA表达
末次给药后4 h处死小鼠，每组取5只小鼠背部注射处皮肤，置于冻存管，液氮迅速冷冻10 min，-80 ℃保存。采用高纯总RNA快速提取试剂盒提取皮肤组织总RNA，操作按试剂盒说明书进行，逆转录获到cDNA，设计Notch2、NICD1特异性引物，以Rn18s为内参，进行qPCR。反应条件：94 ℃预变性2 min;94 ℃变性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸95 s，35个循环;72 ℃最后延伸5 min。采用2-ΔΔct法分析Notch2、NICD1 mRNA的相對表达量，Δct=ct目标基因-ct内参基因，ΔΔct=Δct实验组-Δct对照组。qPCR引物序列见表1。 2.5 酶联免疫吸附法检测皮肤组织中DLL3含量
取各组15只处死小鼠背部皮肤，加入生理盐水，组织匀浆机研磨成组织匀浆，浓度为10%，4 000 r/min（离心半径8.3 cm）离心10 min后提取上清液。按小鼠DLL3酶联免疫试剂盒相关操作测定上清液中DLL3含量，并以每1 mL上清液中总蛋白含量（BCA法蛋白定量试剂盒测定）校正结果。
2.6 免疫组化法检测皮肤组织中Jagged1蛋白表达
各组取5只处死小鼠的背部注射区皮肤，4%多聚甲醛中固定、脱水、包埋、切片，脱蜡，放入柠檬酸钠液中，微波修复5 min，用3% H2O2封闭20 min，磷酸盐缓冲液冲洗，加入兔抗小鼠Jagged1抗体（1 ∶ 100稀释），4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗 （1 ∶ 100稀释），室温孵育1 h，二氨基联苯胺法（DAB）染色，苏木精复染。用显微镜摄片后输入计算机，Image Pro Plus 6.0专业图像分析软件对图片进行分析，调整图像分析软件在相同条件下计算积分光密度（IOD）和组织面积（area），再按公式计算平均光密度（MOD），MOD=IOD/area。各实验组MOD与空白对照组MOD的比值作为Jagged1的相对表达量。
2.7 统计学方法
采用 SPSS 11.0 软件进行统计分析。采用方差分析各组差异，SNK-q法分析两组间均数差异。P<0.05表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 皮肤组织中Notch2、NICD1 mRNA相对表达量比较
与空白对照组比较，模型组皮肤组织中Notch2、NICD1 mRNA相对表达量显著升高，差异均有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，刺山柑总生物碱高剂量组和阳性对照组小鼠皮肤组织中Notch2 mRNA相对表达量显著降低，刺山柑总生物碱中、高剂量组和阳性对照组小鼠皮肤组织中NICD1 mRNA相对表达量显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与阳性对照组比较，刺山柑总生物碱高剂量组小鼠皮肤组织中Notch2、NICD1 mRNA相对表达量无明显变化（P>0.05）。各组小鼠皮肤组织中Notch2、NICD1 mRNA相对表达量的结果见图1。
3.2 皮肤组织中DLL3含量比较
与空白对照组比较，模型组皮肤组织中DLL3含量显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，刺山柑总生物碱低、中、高剂量组和阳性对照组小鼠皮肤组织中DLL3含量显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与阳性对照组比较，刺山柑总生物碱中、高剂量组小鼠皮肤组织中DLL3含量无明显变化（P>0.05）。各组小鼠皮肤组织中DLL3含量测定结果见表2。
3.3 皮肤组织中Jagged1蛋白相对表达量比较
与空白对照组比较，模型组皮肤组织中Jagged1蛋白相对表达量显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，刺山柑总生物碱中、高剂量组和阳性对照组小鼠皮肤组织中Jagged1蛋白相对表达量显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与阳性对照组比较，刺山柑总生物碱高剂量组小鼠皮肤组织中Jagged1蛋白相对表达量无明显变化（P>0.05）。各组小鼠皮肤组织中Jagged1蛋白表达的免疫组化图见图2，相对表达量的结果见图3。
4 讨论
SSc是一种多组织呈现慢性炎症和纤维化的自身免疫性疾病，目前认为SSc病因是由于成纖维细胞活化，合成胶原、纤维连接蛋白等增多，造成细胞外基质沉积，引发组织纤维化[11-12]。目前，SSc的治疗缺乏明确有效的药物，多以免疫抑制、抗纤维化及对症治疗为主，青霉胺是目前临床上治疗系统性硬皮病较经典和常用的药物[1，8]，故本文选择青霉胺做为阳性对照药物。
Notch信号通路是一种进化上高度保守，广泛存在于多种组织细胞中的，对细胞的生长、发育、凋亡等发挥重要作用的信号通路[13]。Notch信号通路的异常激活参与了多种器官纤维化疾病，调节Notch信号通路可能对治疗纤维化疾病有一定作用[14]。哺乳动物Notch信号的受体有4种，分别是Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，而Notch的配体蛋白共有5种，分别是Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3和DLL4[15]。Notch受体与配体相互作用而激活，两者的结合导致受体构象发生改变，在解整合素金属蛋白酶（ADAM）蛋白酶的作用下，释放出NICD，NICD发生核转位，可激活影响细胞的分化、增殖和凋亡的基因如Hes和Hey等的转录[16-17]。
有研究提示，Notch信号通路参与了SSc纤维化的形成，发生纤维化的SSc患者皮肤组织和成纤维细胞的Notch通路被激活，Notch配体Jagged1过表达及NICD蓄积，可以导致SSc患者皮肤组织的纤维化，并可引起免疫功能紊乱和自身抗体的失衡[18-19];用次氯酸、博来霉素诱导的SSc模型鼠及紧皮鼠（Tsk-1鼠）皮肤和肺组织也发现了NICD表达增高[18];用Notch SiRNA抑制Notch表达可改善SSc小鼠皮肤增厚和纤维化[20]。Notch信号通路与SSc成纤维细胞活化相关，用重组的Jagged1可以刺激SSc成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，表达高水平的α-平滑肌肌动蛋白，产生大量的胶原和细胞外基质[19]。本研究结果发现，模型组小鼠皮肤组织中Notch2、NICD1 mRNA和DLL3含量、Jagged1蛋白表达升高，提示SSc模型小鼠存在Notch通路的异常激活;450、900 mg/kg的刺山柑总生物碱可明显降低Notch2、NICD1 mRNA和DLL3含量、Jagged1蛋白表达，提示刺山柑总生物碱可抑制Notch受体与配体的相互作用，抑制NICD蓄积及核转位，对SSc小鼠Notch通路的异常激活有一定抑制作用。 综上所述，刺山柑总生物碱可抑制SSc模型小鼠皮肤组织中Notch2、NICD1、DLL3及Jagged1的异常表达，结合本课题组前期研究结果：刺山柑总生物碱可改善SSc模型小鼠皮肤纤维化[5-7]，提示刺山柑总生物碱可能通过抑制Notch通路的异常激活，抑制胶原生成，降解细胞外基质，改善SSc皮肤纤维化。
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（收稿日期：2019-07-30 修回日期：2019-10-11）
（編辑：邹丽娟）