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摘要 本研究以根结线虫生防真菌交枝顶孢Acremonium implicatum为供试菌株，探究了菌龄、降解酶种类、酶解温度和时间、不同渗透压稳定剂、不同pH等因素对其原生质体制备的影响，并建立了交枝顶孢原生质体制备体系;制备的原生质体在SR培养基上再生率达到17.78%。此外，GFP遗传转化菌株的获得充分表明制备的原生质体可作为后续遗传转化材料，为进一步研究交枝顶孢对根结线虫的生防机理奠定基础。
关键词 交枝顶孢; 原生质体制备; 再生; 绿色荧光蛋白
中图分类号： S 435.45; S 476
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2019447
Abstract In order to establish protoplast-mediated genetic transformation of the biocontrol fungus Acremonium implicatum， the conditions for the isolation and regeneration of A.implicatum protoplasts were optimized， including culture time， enzyme system， enzymatic digestion time and temperature， type of osmotic stabilizers， pH value and so on. For the preparation of protoplasts， solid regeneration medium was better with a regeneration rate of protoplasts of 17.78%. The transformant strain with GFP was obtained. The system may build a foundation for further study on the mechanism of biocontrol against the root-knot nematode.
Key words Acremonium implicatum; protoplast preparation; regeneration; GFP
根结线虫Meloidogyne spp.是一类世界性分布的重要植物病原物，给全球农业生产带来了巨大的经济损失[1]。蔬菜生产是农业生产中不可或缺的一部分，随着保护地蔬菜种植面积的逐年增加，根结线虫病害发生日益严重。根结线虫种类繁多，分布广，致病性强且寄主范围广泛、环境适应性强，能侵染几乎所有的蔬菜作物[1-2]。在蔬菜作物中，以茄科、十字花科和葫芦科等受害最重[3]。蔬菜作物被根结线虫侵染后会导致产量降低，品质下降。根结线虫还会与其他病原物形成复合侵染，造成更加严重的经济损失。根结线虫的防治主要为土壤熏蒸剂和化学杀虫剂[4]，但是由于使用不规范、危害人类健康、污染环境等问题的频繁出现，越来越多的化学农药被禁止使用[5-6]。寻找高效且环境友好的根结线虫防治措施是当前亟待解决的问题之一。因此应用微生物防治根结线虫已经成为国内外研究的重点内容。木霉Trichoderma spp.[7-8]、拟青霉Paecilomyces spp.[9]以及枝顶孢Acremonium spp.[10-11]等生防菌对根结线虫的防治效果显著。然而，对生防真菌防治线虫机制的研究相对较少，限制了当前生物防治方法的应用。鑒于这种情况，需要加深对生防真菌防控机理的研究，而这项研究的关键技术就是建立生防菌的高效遗传转化体系。丝状真菌高效遗传转化体系的构建一般通过农杆菌介导或者聚乙二醇介导的原生质体转化来实现[12-17]。原生质体转化具有转化效率高、操作简单等特点，因此原生质体的制备是遗传转化的首要问题。
近年来，许多学者对丝状真菌遗传转化进行了大量的研究，但是由于真菌细胞壁组成和结构十分复杂，制备原生质体的体系和条件存在很大的差别。交枝顶孢A.implicatum对根结线虫具有良好的生防作用[18-19]，考虑到其在线虫防治中良好的应用前景，对该菌进行原生质体制备与再生的研究，可为A.implicatum遗传体系的建立以及该菌生防机理的研究奠定良好的基础。
1 材料与方法
1.1 菌株
交枝顶孢A.implicatum菌株由中国农业科学院蔬菜花卉研究所蔬菜病害室保存。
1.2 培养基和试剂
马铃薯汤汁培养基（马铃薯200 g，D-葡萄糖20 g，定容至1 L;PDB）用于菌株产孢。马铃薯固体培养基（马铃薯汤汁培养基，1.5%琼脂;PDA）用于制备新鲜菌丝。固体再生培养基（0.1%酵母提取物，01%酶水解干酪素，1 mol/L蔗糖， 0.7%琼脂粉;SR），液体再生培养基（0.1%酵母提取物，0.1%酶水解干酪素，1 mol/L蔗糖; LR）。
原生质体制备所需试剂：PTC溶液（60%聚乙二醇3350，10 mmol/L Tris-Cl pH 7.5，50 mmol/L氯化钙），STC溶液（1.2 mol/L山梨醇，50 mmol/L氯化钙，10 mmol/L Tris-HCl）。
1.3 交枝顶孢原生质体的制备
本试验采用酶解细胞壁法制备生防真菌交枝顶孢的原生质体。设置菌丝培养时间、裂解酶系统、酶解时间和温度、不同pH等试验参数，建立该菌株原生质体制备和再生体系。
1.3.1 菌丝培养时间对原生质体制备的影响
参照Parsons等[20]的方法制备原生质体并略有改动。交枝顶孢菌株在PDA平板上28℃黑暗培养5 d，用5 mm打孔器在菌落边缘打孔，取一菌块置于PDB中25℃，150 r/min 培养2 d，收集孢子并制备成均匀的孢子悬浮液（1×108个/mL）。取1 mL孢子悬浮液置于100 mL PDB中25℃， 150 r/min分别培养24、36、48、60、72 h，用灭菌过滤网过滤，然后用渗透压稳定剂反复充分冲洗收集菌丝，待菌丝冲洗至团状后转至灭菌的50 mL离心管中（离心管需提前称重），整个操作过程在超净工作台进行。用离心管称取收集好的菌丝0.5 g，加入2 mL酶解液（20 mg/mL崩溃酶）后置于摇床上振荡孵育，3 h后观察原生质体获得率，选出最适宜制备交枝顶孢原生质体的菌龄。试验设置3次重复。 1.3.2 裂解酶系统对原生质体制备的影响
依据上述确定的最佳培养时间培养分生孢子并收集菌丝。试验设置A、B两个裂解酶体系进行酶解，其中裂解酶A为：20 mg/mL崩溃酶（Sigma， Germany）;裂解酶B组成：10 mg/mL纤维素酶（Sigma，Germany） 10 mg/mL溶壁酶（Sigma，Germany）。试验设置3次重复。
1.3.3 酶解温度和酶解时间对原生质体制备的影响
根据以上确定的菌丝最佳培养时间、最佳酶解体系分别在26、28、30℃和32℃下120 r/min酶解3 h，过滤收集原生质体并用血球计数板计数，确定最佳酶解温度。试验设置3次重复。
根据菌丝最佳培养时间、最佳酶解体系和最佳酶解温度将菌丝分别裂解1、2、3、4 h和5 h，然后过滤收集原生质体并计数。试验设置3次重复。
1.3.4 不同渗透压稳定剂对原生质体制备的影响
在酶解体系中，渗透压稳定剂提供原生质体正常形态所需的环境条件，试验中的渗透压稳定剂分别设置为0.7 mol/L NaCl、0.7 mol/L山梨醇和1.2 mol/L蔗糖。
1.3.5 不同pH对原生质体制备的影响
根据上述确定的最佳培养时间、最佳酶解体系、最佳裂解温度，调节渗透压稳定剂的pH，以确定最适pH。pH分别设置为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。试验设置3次重复。
1.4 原生质体的再生
采用双层覆盖法对原生质体进行再生培养[21-22]。取0.1 mL浓度为1×104 cfu/mL的原生质体溶液与12 mL温度50℃左右的SR培养基或PDA培养基混匀倒入培养皿中，再向其中分别倒入温度50℃左右的相同培养基（琼脂含量1%），均匀覆盖培养皿;待培养基凝固后置于28℃培养箱黑暗培养。同时，取0.1 mL上述浓度的原生质体溶液并加入1 mL无菌水，室温静置30 min使原生质体崩溃裂解，再以同样的方法进行培养作为对照，以抵消非原生质体形成的菌落而产生的误差。每种培养基设置3个重复。原生质体再生率计算公式如下：
再生率=（原生质体再生菌落数-对照组再生菌落数）/原生质体总数×100%。
1.5 原生质体的转化
原生质体转化参照Rehman等的方法，并略有改动[23]。将原生质体分装到50 mL的离心管中，每管200 μL，加入线性化（Hind Ⅲ单酶切）的质粒DNA（每管加入2 μg质粒），用STC补足至300 μL，冰上放置20 min;缓慢逐滴加入2 mL PTC溶液，冰上静置20 min;每管加入30 mL预冷的STC混匀，4 000 r/min，4℃离心15 min;弃上清液，每管加入3 mL LR，28℃静止培养12～18 h;将培养物倒入培养皿中，加入约12 mL SR（温度降低至50℃左右，防止将原生质体烫死），混匀。
1.6 数据分析
数据用 SAS 9.1进行方差分析，LSD法进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 原生质体的制备
2.1.1 菌丝培養时间对原生质体产量的影响
酶解试验表明，随着培养时间的增加，原生质体数量呈现先增加后减少的状态，当交枝顶孢菌丝的培养时间为36 h时，所获得的原生质体最多。如图1所示，随着培养时间的增加菌丝量增加，原生质体产量增加;但培养时间继续增加，所制备的原生质体产量降低。这表明，菌丝培养时间长，菌丝的细胞壁成分和结构发生变化，较难被酶裂解消化，原生质体的产量也就随之降低。
2.1.2 裂解酶系统对原生质体产量的影响
不同裂解酶对交枝顶孢原生质体的产量影响较大。试验结果表明酶解交枝顶孢新鲜菌丝时，采用崩溃酶的处理原生质体产量较高，为2.7×107 cfu/mL; 10 mg/mL纤维素酶与溶壁酶混合酶液处理产量较低，为1.2×107 cfu/mL，显著低于崩溃酶处理的结果（图2）。
2.1.3 酶解温度和酶解时间对原生质体制备的影响
酶解温度试验表明，在 27～33℃范围内，交枝顶孢原生质体均有较高的产量，且以28℃时原生质体产量最高，为 3.1×107 cfu/mL（图3）。
在菌丝酶解的初始阶段，随着酶解时间的增加，原生质体的产量逐渐增加。酶解1 h，原生质体的产量较少，仅为1×106 cfu/mL;酶解2 h，原生质体产量为6×106 cfu/mL;当酶解 3 h，原生质体的产量达到最高值，为1.8×107 cfu/mL;酶解4 h，原生质体产量下降，为 1.5×107 cfu/mL（图4）。这表明，适当增加酶解时间利于交枝顶孢原生质体的产生，但如果酶解时间过长，原生质体的产量降低，酶解3 h为最佳酶解时间。
2.1.4 渗透压稳定剂对原生质体制备的影响
渗透压稳定剂一方面可以维持制备的原生质体细胞内外渗透压平衡，另一方面会影响裂解酶活性，影响原生质体的产量。相同条件下，以NaCl作为渗透压稳定剂原生质体的获得量更高，达到2.6×107 cfu/mL（图5）。
2.1.5 pH对原生质体制备的影响
渗透压稳定剂的pH是影响酶活性的一个重要因素。试验结果表明，较高的pH不利于酶活性的发挥，稍酸性的pH有利于酶解反应的进行，pH=6.5时原生质体的产量最高，能达到2.3×107 cfu/mL。
2.2 原生质体的再生
原生质体在PDA和SR培养基上再生情况不同。原生质体在PDA和SR上的再生率分别为1055%和17.78%（图7）。SR作为再生培养基显著优于PDA培养基。
2.3 原生质体的转化 為了检测制备的原生质体能否用于转化，将构建好的含有GFP基因的表达载体pCH-sGFP（中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供）通过聚乙二醇介导的方法进行遗传转化。在蓝色激发光下，观察到转化子发出明亮的绿色荧光（图8），说明GFP基因已经成功转入交枝顶孢A.implicatum中，且能够正常表达。
3 结论与讨论
原生质体的制备和再生是建立真菌遗传转化体系过程中的关键技术，直接影响遗传转化效率。本研究采用单因素试验研究了影响内生真菌交枝顶孢原生质体制备和再生的条件，明确了交枝顶孢原生质体制备及再生的最适宜条件为：孢子液摇培36 h，用灭菌的过滤网过滤后，以pH为6.5的0.7 mol/L NaCl为渗透压稳定剂反复洗涤菌丝，用浓度为20 mg/mL的崩溃酶按照0.5 g菌丝：2 mL酶液在28℃恒温（120 r/min）酶解3 h，以SR培养基为再生培养基。
研究发现制备原生质体时菌丝的生理状态对原生质体产量和质量有着重要的影响。通常在菌丝线性生长早期原生质体容易制备，但也并不是菌丝越幼嫩越容易酶解。菌丝在其生长的某个阶段对降解酶最为敏感，可能是由于菌丝不同生长阶段细胞壁的结构组成不同，使得其对降解酶的敏感性不同[24-25]。
不同种类真菌细胞壁组成和结构不同，所用的裂解酶和酶解时间差异很大。弭宝彬等发现15 mg/mL崩溃酶对尖孢镰刀菌辣椒专化型Fusarium oxysporum f. sp. capsicum酶解效率最高[26]。赵小强等对制备大丽轮枝菌Verticillium dahliae原生质体的条件进行优化时发现，裂解酶浓度为10 mg/mL时原生质体产量最高[27]。因此，细胞壁降解酶是原生质体制备的另一个关键因素。试验采用了两种降解酶系统，试验结果表明对于交枝顶孢而言，20 mg/mL的崩溃酶酶解效果优于纤维素酶和溶壁酶混合酶的酶解效果。
在交枝顶孢原生质体制备的过程中，原生质体的数量随着酶解时间的延长呈现先增加后减少的趋势，在3 h时达到峰值，可能的原因为酶解时间长导致酶液活性降低或原生质体破裂。时涛等在橡胶多主棒孢的原生质体制备以及李伶俐等在甘蓝枯萎病菌原生质体制备研究中也有类似发现[28-29]。
本研究建立了食线虫真菌交枝顶孢原生质体的制备和再生体系，同时探明了体系相关的影响因素，为进一步研究交枝顶孢对根结线虫的生防机理提供了重要的材料基础。
参考文献
[1] ABAD P， GOUZY J， AURY J M， et al. Genome sequence of the metazoan plant-parasitic nematode Meloidogyne incognita [J]. Nature Biotechnology， 2008， 26（8）： 909-915.
[2] TRUDGILL D L， BLOK V C. Apomictic， polyphagous root-knot nematodes： exceptionally successful and damaging biotrophic root pathogens [J]. Annual Review of Phytopathology，2001，39（1）：53-77.
[3] 刘维志. 植物病原线虫学[M]. 北京：中国农业出版社，2000.
[4] NOLING J， BECKER J O. The challenge of research and extension to define and implement alternatives to methyl bromide[J].Journal of Nematology， 1994，26（4S）： 573.
[5] 董锦艳，张克勤，赵智娴，等.杀线虫菌物毒素的研究进展（Ⅱ）[J].中国生物防治，2001，17（3）：138-141.
[6] AMARAL D R， OLIVEIRA F E R， OLIVEIRA D F， et al. Purification of a Fusarium moniliforme metabolite toxic to Meloidogyne exigua [J]. Summa Phytopathologica （Brazil）， 2003，29（1）：25-29.
[7] SHARON E， BAR-EYAL M， CHET I， et al. Biological control of the root-knot nematode Meloidogyne javanica by Trichoderma harzianum [J]. Phytopathology， 2001，91（7）： 687-693.
[8] GOSWAMI J， PANDEY R K， TEWARI J P， et al. Management of root knot nematode on tomato through application of fungal antagonists， Acremonium strictum and Trichoderma harzianum [J]. Journal of Environmental Science and Health Part B， 2008， 43（3）：237-240.
[9] KIEWNICK S， SIKORA R A. Biological control of the root-knot nematode Meloidogyne incognita by Paecilomyces lilacinusstrain 251 [J]. Biological Control， 2006， 38（2）： 179-187.
关键词 交枝顶孢; 原生质体制备; 再生; 绿色荧光蛋白
中图分类号： S 435.45; S 476
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2019447
Abstract In order to establish protoplast-mediated genetic transformation of the biocontrol fungus Acremonium implicatum， the conditions for the isolation and regeneration of A.implicatum protoplasts were optimized， including culture time， enzyme system， enzymatic digestion time and temperature， type of osmotic stabilizers， pH value and so on. For the preparation of protoplasts， solid regeneration medium was better with a regeneration rate of protoplasts of 17.78%. The transformant strain with GFP was obtained. The system may build a foundation for further study on the mechanism of biocontrol against the root-knot nematode.
Key words Acremonium implicatum; protoplast preparation; regeneration; GFP
根结线虫Meloidogyne spp.是一类世界性分布的重要植物病原物，给全球农业生产带来了巨大的经济损失[1]。蔬菜生产是农业生产中不可或缺的一部分，随着保护地蔬菜种植面积的逐年增加，根结线虫病害发生日益严重。根结线虫种类繁多，分布广，致病性强且寄主范围广泛、环境适应性强，能侵染几乎所有的蔬菜作物[1-2]。在蔬菜作物中，以茄科、十字花科和葫芦科等受害最重[3]。蔬菜作物被根结线虫侵染后会导致产量降低，品质下降。根结线虫还会与其他病原物形成复合侵染，造成更加严重的经济损失。根结线虫的防治主要为土壤熏蒸剂和化学杀虫剂[4]，但是由于使用不规范、危害人类健康、污染环境等问题的频繁出现，越来越多的化学农药被禁止使用[5-6]。寻找高效且环境友好的根结线虫防治措施是当前亟待解决的问题之一。因此应用微生物防治根结线虫已经成为国内外研究的重点内容。木霉Trichoderma spp.[7-8]、拟青霉Paecilomyces spp.[9]以及枝顶孢Acremonium spp.[10-11]等生防菌对根结线虫的防治效果显著。然而，对生防真菌防治线虫机制的研究相对较少，限制了当前生物防治方法的应用。鑒于这种情况，需要加深对生防真菌防控机理的研究，而这项研究的关键技术就是建立生防菌的高效遗传转化体系。丝状真菌高效遗传转化体系的构建一般通过农杆菌介导或者聚乙二醇介导的原生质体转化来实现[12-17]。原生质体转化具有转化效率高、操作简单等特点，因此原生质体的制备是遗传转化的首要问题。
近年来，许多学者对丝状真菌遗传转化进行了大量的研究，但是由于真菌细胞壁组成和结构十分复杂，制备原生质体的体系和条件存在很大的差别。交枝顶孢A.implicatum对根结线虫具有良好的生防作用[18-19]，考虑到其在线虫防治中良好的应用前景，对该菌进行原生质体制备与再生的研究，可为A.implicatum遗传体系的建立以及该菌生防机理的研究奠定良好的基础。
1 材料与方法
1.1 菌株
交枝顶孢A.implicatum菌株由中国农业科学院蔬菜花卉研究所蔬菜病害室保存。
1.2 培养基和试剂
马铃薯汤汁培养基（马铃薯200 g，D-葡萄糖20 g，定容至1 L;PDB）用于菌株产孢。马铃薯固体培养基（马铃薯汤汁培养基，1.5%琼脂;PDA）用于制备新鲜菌丝。固体再生培养基（0.1%酵母提取物，01%酶水解干酪素，1 mol/L蔗糖， 0.7%琼脂粉;SR），液体再生培养基（0.1%酵母提取物，0.1%酶水解干酪素，1 mol/L蔗糖; LR）。
原生质体制备所需试剂：PTC溶液（60%聚乙二醇3350，10 mmol/L Tris-Cl pH 7.5，50 mmol/L氯化钙），STC溶液（1.2 mol/L山梨醇，50 mmol/L氯化钙，10 mmol/L Tris-HCl）。
1.3 交枝顶孢原生质体的制备
本试验采用酶解细胞壁法制备生防真菌交枝顶孢的原生质体。设置菌丝培养时间、裂解酶系统、酶解时间和温度、不同pH等试验参数，建立该菌株原生质体制备和再生体系。
1.3.1 菌丝培养时间对原生质体制备的影响
参照Parsons等[20]的方法制备原生质体并略有改动。交枝顶孢菌株在PDA平板上28℃黑暗培养5 d，用5 mm打孔器在菌落边缘打孔，取一菌块置于PDB中25℃，150 r/min 培养2 d，收集孢子并制备成均匀的孢子悬浮液（1×108个/mL）。取1 mL孢子悬浮液置于100 mL PDB中25℃， 150 r/min分别培养24、36、48、60、72 h，用灭菌过滤网过滤，然后用渗透压稳定剂反复充分冲洗收集菌丝，待菌丝冲洗至团状后转至灭菌的50 mL离心管中（离心管需提前称重），整个操作过程在超净工作台进行。用离心管称取收集好的菌丝0.5 g，加入2 mL酶解液（20 mg/mL崩溃酶）后置于摇床上振荡孵育，3 h后观察原生质体获得率，选出最适宜制备交枝顶孢原生质体的菌龄。试验设置3次重复。 1.3.2 裂解酶系统对原生质体制备的影响
依据上述确定的最佳培养时间培养分生孢子并收集菌丝。试验设置A、B两个裂解酶体系进行酶解，其中裂解酶A为：20 mg/mL崩溃酶（Sigma， Germany）;裂解酶B组成：10 mg/mL纤维素酶（Sigma，Germany） 10 mg/mL溶壁酶（Sigma，Germany）。试验设置3次重复。
1.3.3 酶解温度和酶解时间对原生质体制备的影响
根据以上确定的菌丝最佳培养时间、最佳酶解体系分别在26、28、30℃和32℃下120 r/min酶解3 h，过滤收集原生质体并用血球计数板计数，确定最佳酶解温度。试验设置3次重复。
根据菌丝最佳培养时间、最佳酶解体系和最佳酶解温度将菌丝分别裂解1、2、3、4 h和5 h，然后过滤收集原生质体并计数。试验设置3次重复。
1.3.4 不同渗透压稳定剂对原生质体制备的影响
在酶解体系中，渗透压稳定剂提供原生质体正常形态所需的环境条件，试验中的渗透压稳定剂分别设置为0.7 mol/L NaCl、0.7 mol/L山梨醇和1.2 mol/L蔗糖。
1.3.5 不同pH对原生质体制备的影响
根据上述确定的最佳培养时间、最佳酶解体系、最佳裂解温度，调节渗透压稳定剂的pH，以确定最适pH。pH分别设置为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。试验设置3次重复。
1.4 原生质体的再生
采用双层覆盖法对原生质体进行再生培养[21-22]。取0.1 mL浓度为1×104 cfu/mL的原生质体溶液与12 mL温度50℃左右的SR培养基或PDA培养基混匀倒入培养皿中，再向其中分别倒入温度50℃左右的相同培养基（琼脂含量1%），均匀覆盖培养皿;待培养基凝固后置于28℃培养箱黑暗培养。同时，取0.1 mL上述浓度的原生质体溶液并加入1 mL无菌水，室温静置30 min使原生质体崩溃裂解，再以同样的方法进行培养作为对照，以抵消非原生质体形成的菌落而产生的误差。每种培养基设置3个重复。原生质体再生率计算公式如下：
再生率=（原生质体再生菌落数-对照组再生菌落数）/原生质体总数×100%。
1.5 原生质体的转化
原生质体转化参照Rehman等的方法，并略有改动[23]。将原生质体分装到50 mL的离心管中，每管200 μL，加入线性化（Hind Ⅲ单酶切）的质粒DNA（每管加入2 μg质粒），用STC补足至300 μL，冰上放置20 min;缓慢逐滴加入2 mL PTC溶液，冰上静置20 min;每管加入30 mL预冷的STC混匀，4 000 r/min，4℃离心15 min;弃上清液，每管加入3 mL LR，28℃静止培养12～18 h;将培养物倒入培养皿中，加入约12 mL SR（温度降低至50℃左右，防止将原生质体烫死），混匀。
1.6 数据分析
数据用 SAS 9.1进行方差分析，LSD法进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 原生质体的制备
2.1.1 菌丝培養时间对原生质体产量的影响
酶解试验表明，随着培养时间的增加，原生质体数量呈现先增加后减少的状态，当交枝顶孢菌丝的培养时间为36 h时，所获得的原生质体最多。如图1所示，随着培养时间的增加菌丝量增加，原生质体产量增加;但培养时间继续增加，所制备的原生质体产量降低。这表明，菌丝培养时间长，菌丝的细胞壁成分和结构发生变化，较难被酶裂解消化，原生质体的产量也就随之降低。
2.1.2 裂解酶系统对原生质体产量的影响
不同裂解酶对交枝顶孢原生质体的产量影响较大。试验结果表明酶解交枝顶孢新鲜菌丝时，采用崩溃酶的处理原生质体产量较高，为2.7×107 cfu/mL; 10 mg/mL纤维素酶与溶壁酶混合酶液处理产量较低，为1.2×107 cfu/mL，显著低于崩溃酶处理的结果（图2）。
2.1.3 酶解温度和酶解时间对原生质体制备的影响
酶解温度试验表明，在 27～33℃范围内，交枝顶孢原生质体均有较高的产量，且以28℃时原生质体产量最高，为 3.1×107 cfu/mL（图3）。
在菌丝酶解的初始阶段，随着酶解时间的增加，原生质体的产量逐渐增加。酶解1 h，原生质体的产量较少，仅为1×106 cfu/mL;酶解2 h，原生质体产量为6×106 cfu/mL;当酶解 3 h，原生质体的产量达到最高值，为1.8×107 cfu/mL;酶解4 h，原生质体产量下降，为 1.5×107 cfu/mL（图4）。这表明，适当增加酶解时间利于交枝顶孢原生质体的产生，但如果酶解时间过长，原生质体的产量降低，酶解3 h为最佳酶解时间。
2.1.4 渗透压稳定剂对原生质体制备的影响
渗透压稳定剂一方面可以维持制备的原生质体细胞内外渗透压平衡，另一方面会影响裂解酶活性，影响原生质体的产量。相同条件下，以NaCl作为渗透压稳定剂原生质体的获得量更高，达到2.6×107 cfu/mL（图5）。
2.1.5 pH对原生质体制备的影响
渗透压稳定剂的pH是影响酶活性的一个重要因素。试验结果表明，较高的pH不利于酶活性的发挥，稍酸性的pH有利于酶解反应的进行，pH=6.5时原生质体的产量最高，能达到2.3×107 cfu/mL。
2.2 原生质体的再生
原生质体在PDA和SR培养基上再生情况不同。原生质体在PDA和SR上的再生率分别为1055%和17.78%（图7）。SR作为再生培养基显著优于PDA培养基。
2.3 原生质体的转化 為了检测制备的原生质体能否用于转化，将构建好的含有GFP基因的表达载体pCH-sGFP（中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供）通过聚乙二醇介导的方法进行遗传转化。在蓝色激发光下，观察到转化子发出明亮的绿色荧光（图8），说明GFP基因已经成功转入交枝顶孢A.implicatum中，且能够正常表达。
3 结论与讨论
原生质体的制备和再生是建立真菌遗传转化体系过程中的关键技术，直接影响遗传转化效率。本研究采用单因素试验研究了影响内生真菌交枝顶孢原生质体制备和再生的条件，明确了交枝顶孢原生质体制备及再生的最适宜条件为：孢子液摇培36 h，用灭菌的过滤网过滤后，以pH为6.5的0.7 mol/L NaCl为渗透压稳定剂反复洗涤菌丝，用浓度为20 mg/mL的崩溃酶按照0.5 g菌丝：2 mL酶液在28℃恒温（120 r/min）酶解3 h，以SR培养基为再生培养基。
研究发现制备原生质体时菌丝的生理状态对原生质体产量和质量有着重要的影响。通常在菌丝线性生长早期原生质体容易制备，但也并不是菌丝越幼嫩越容易酶解。菌丝在其生长的某个阶段对降解酶最为敏感，可能是由于菌丝不同生长阶段细胞壁的结构组成不同，使得其对降解酶的敏感性不同[24-25]。
不同种类真菌细胞壁组成和结构不同，所用的裂解酶和酶解时间差异很大。弭宝彬等发现15 mg/mL崩溃酶对尖孢镰刀菌辣椒专化型Fusarium oxysporum f. sp. capsicum酶解效率最高[26]。赵小强等对制备大丽轮枝菌Verticillium dahliae原生质体的条件进行优化时发现，裂解酶浓度为10 mg/mL时原生质体产量最高[27]。因此，细胞壁降解酶是原生质体制备的另一个关键因素。试验采用了两种降解酶系统，试验结果表明对于交枝顶孢而言，20 mg/mL的崩溃酶酶解效果优于纤维素酶和溶壁酶混合酶的酶解效果。
在交枝顶孢原生质体制备的过程中，原生质体的数量随着酶解时间的延长呈现先增加后减少的趋势，在3 h时达到峰值，可能的原因为酶解时间长导致酶液活性降低或原生质体破裂。时涛等在橡胶多主棒孢的原生质体制备以及李伶俐等在甘蓝枯萎病菌原生质体制备研究中也有类似发现[28-29]。
本研究建立了食线虫真菌交枝顶孢原生质体的制备和再生体系，同时探明了体系相关的影响因素，为进一步研究交枝顶孢对根结线虫的生防机理提供了重要的材料基础。
参考文献
[1] ABAD P， GOUZY J， AURY J M， et al. Genome sequence of the metazoan plant-parasitic nematode Meloidogyne incognita [J]. Nature Biotechnology， 2008， 26（8）： 909-915.
[2] TRUDGILL D L， BLOK V C. Apomictic， polyphagous root-knot nematodes： exceptionally successful and damaging biotrophic root pathogens [J]. Annual Review of Phytopathology，2001，39（1）：53-77.
[3] 刘维志. 植物病原线虫学[M]. 北京：中国农业出版社，2000.
[4] NOLING J， BECKER J O. The challenge of research and extension to define and implement alternatives to methyl bromide[J].Journal of Nematology， 1994，26（4S）： 573.
[5] 董锦艳，张克勤，赵智娴，等.杀线虫菌物毒素的研究进展（Ⅱ）[J].中国生物防治，2001，17（3）：138-141.
[6] AMARAL D R， OLIVEIRA F E R， OLIVEIRA D F， et al. Purification of a Fusarium moniliforme metabolite toxic to Meloidogyne exigua [J]. Summa Phytopathologica （Brazil）， 2003，29（1）：25-29.
[7] SHARON E， BAR-EYAL M， CHET I， et al. Biological control of the root-knot nematode Meloidogyne javanica by Trichoderma harzianum [J]. Phytopathology， 2001，91（7）： 687-693.
[8] GOSWAMI J， PANDEY R K， TEWARI J P， et al. Management of root knot nematode on tomato through application of fungal antagonists， Acremonium strictum and Trichoderma harzianum [J]. Journal of Environmental Science and Health Part B， 2008， 43（3）：237-240.
[9] KIEWNICK S， SIKORA R A. Biological control of the root-knot nematode Meloidogyne incognita by Paecilomyces lilacinusstrain 251 [J]. Biological Control， 2006， 38（2）： 179-187.