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摘 要：为了优化全蚀病生防菌株YB-81的发酵培养基及培养条件，提高其对全蚀病的抑制效果，在单因素试验的基础上，利用响应面法（Response surface methodology）对小麦全蚀病生防菌株YB-81的发酵条件进行优化。生防菌株YB-81的最优发酵条件为：时间36 h，温度36 ℃，初始pH值8.0，转速200 r·min-1，牛肉膏+葡萄糖（1∶1）0.53%，蛋白胨0.99%，氯化钠0.20%。在此培养条件下试验，其菌落总数为18.8亿个·mL-1，较基础培养基提高了72%，对全蚀病菌抑制率达到87.2%，较优化前提高了32.5%。生防菌 YB-81的最优发酵培养条件的确定， 可为该菌大规模生产应用提供理论基础。
关键词：小麦全蚀病；生防菌；响应面法；发酵
中图分类号： S476.1 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.09.013
Abstract： In order to raising the antagonistic effect， the growth conditions and culture medium of biocontrol strain YB-81 was optimized based on single factor test. The optimal culture conditions of the biocontrol strain YB-81 were determined for 0.53% beef extract+glucose（1∶1）， 0.99% peptone， 0.20% odium chloride， temperature at 36 ℃， pH 8.0， speeding at 200 r·min-1， the incubation time of 36 h. The total numbers of colony was 1.88×109·mL-1， improving by 72%， and the inhibition rate to Gaeumannomyces gramims was 87.2%， improving by 32.5% with the optimal growth conditions. The optimal growth condition of the biocontrol strain YB-81 was identified， providing a theoretical basis for enlargement of production.
Key words： wheat take-all；biocontrol strain；response surface methodology；fermentation
小麦全蚀病（Wheat take-all）是一种典型的根部土传病害，由子囊菌亚门的禾顶囊壳菌小麦变种（Gaeumannomyces gramims var. tritici）侵染所致[1-4]。小麦发病后，植株根部变黑，分蘖减少，成穗率降低，千粒质量下降，甚至全株枯死，减产幅度很大，民间称此病害为“小麦癌症”。最近5年，小麦全蚀病扩展迅速，造成严重危害， 且防控困难已经成为一种非常顽固的土传病害。目前，对全蚀病的防治依靠化学药剂拌种，常规药剂防治效果不好，全蚀净防效较好但成本太高。
YB-81菌株是河南省农业科学院植物保护研究所利用现代微生物筛选和分子生物学技术培育出的对小麦全蚀病具有高效抑制作用的枯草芽孢杆菌，通过室内生测试验以及田间试验证明对小麦全蚀病菌有较好的防治作用，目前该菌株专利已授权（专利号2010101 99739.1）。本试验采用响应面法优化了该菌株的发酵条件，目的是为提高该菌株的防病效果，进一步中试生产，为应用于大田提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 材 料
供试菌株及培养基：枯草芽孢杆菌YB-81和小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces gramims var. tritici）均由河南省农业科学院植物保护研究所提供。基础培养基为NA培养基，小麦全蚀病菌培养基为PDA。
1.2 方 法
1.2.1 生长量的测定 采用平板菌落计数法[5]。各处理培养液用梯度稀释法稀释涂板后，37 ℃恒温倒置培养36～48 h，调查平板菌落数，然后计算活菌数（cfu·mL-1）。
1.2.2 抑菌率测定 抑菌率的测定采用含毒介质法[6]。
1.2.3 发酵条件优化 通过单因素试验，测定不同时间、温度、初始pH值、药瓶转速对YB-81菌株发酵效果的影响。
1.2.4 响应面优化试验 响应面法优化发酵培养基试验设计，选取对发酵培养基有显著影响的3个因素即碳源、氮源及无机离子，采用单因素试验方法确定3个因素的试验点，每个因素选择2个水平，测定各发酵培养基中芽孢杆菌的生长量。在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken中心组合设计原理，选取碳源牛肉膏+葡萄糖（1∶1） （g）、氮源蛋白胨（g）、无机离子氯化钠（g）3个因素来研究发酵培养基最佳条件，以菌落总数为响应值，利用Design-Exper.8.05软件设计了3因素3水平的响应面试验（表1）。
2 结果与分析
2.1 最优发酵条件
通过设置不同时间、温度、初始pH值、摇瓶转速优化菌株YB-81的发酵条件，结果如图1～图4所示。菌落总数与抑菌率的变化趋势基本一致，菌落总数越高，抑菌率也越高。发酵时间36 h抑制率达最高80.6%，菌落总数16.6亿个·mL-1；随着发酵温度的上升菌落总数逐渐增多，在36 ℃时发酵代谢物此时的抑菌作用最强，菌落生长总数也最多，40 ℃ 时抑制率明显降低；pH值8.0时，抑制率和菌落总数均在最高点，与其他处理差异显著；芽孢杆菌在5个不同摇床转速条件下，抑制率变化不明显，菌落总数逐渐增多，在200 r·min-1菌落总数达到最大值16.2亿个·mL-1。 2.2 生防芽孢杆菌YB-81发酵培养基试验设计
通过单因素试验，得出发酵培养基（100 mL）中最佳碳源葡萄糖+牛肉膏（1∶1）添加量为0.5 g，最佳氮源蛋白胨1.0 g，最佳无机离子氯化钠0.20 g。
2.3 响应面法优化培养基
2.3.1 响应面优化试验 以菌落总数为响应值，利用Design-Exper.8.05软件设计了3因素3水平的响应面试验，菌落总数响应曲面分析试验结果见表2。
根据软件对表2中试验结果进行多元回归拟合，得到生防芽孢杆菌培养基设计过程中A碳源、B氮源、C无机离子的二次多项回归模型：
Y=+177.60+2.00A-5.88B+1.62C+9.75AB+0.25AC-1.50BC-88.30A2-27.05B2-45.55C2
2.3.2 响应曲面方差分析 通过表3可以看出，该模型的F值为38.03说明模型是显著的，各因素中BC和B2显著；均二次方A2、C2极显著。
2.3.3 响应曲面图与等高值线图的分析 交互效应的强弱可用等高线的形状来映出， 椭圆形表示两因素交互作用显著， 而圆形则与之相反。由图4～图6可知，碳源葡萄糖+牛肉膏（1∶1）（A）、氮源蛋白胨（B）、无机离子氯化钠（C）之间的相互作用对菌落总数的影响。
如图中4所示，碳源与氮源之间存在交互作用，当碳源在零水平时，在氮源增加的同时，菌落总数也逐渐增加，当碳源超过0.5 g以后，菌落总数不再增加。从等高线图中可直观看出两因素交互作用不显著。
图5显示了碳源与无机离子之间交互作用不显著，从其等高线可直观看出，因为等高线的形状反应了交互效应的强弱大小，圆形表示两个因素作用不显著。
由图6可知，把氮源加入量固定于零水平（1.0 g）时，氮源与培养基中无机离子交互影响效应特点是：随着氮源的变化，菌落总数先上升后降低；适当的增加氮源可以减少一定量无机离子。说明氮源与无机离子有一定的交互作用。
以上3个响应面均为开口向下，说明响应值（菌落总数）存在极大值，3个图形的等高线中心均位于-1～1之间，表明培养基最优条件存在于所设计的因素水平范围之内。模型培养基优化条件为：碳源0.53 g，氮源0.99 g， 无机离子0.20 g，在此条件下，模型预测菌落总数为168.408 ×107个·mL-1。
2.3.4 模型验证 通过Plackett-Burman试验设计筛选出全蚀病生防菌株YB-81发酵培养基的3个影响因素，模型理论条件牛肉膏+葡萄糖（1∶1）0.53%，蛋白胨0.99%，氯化钠0.20%，这3个主要因素对菌株YB-81生长条件存在显著影响。在此条件下进行验证试验，经3次平行验证试验，取平均值，实际菌落总数为18.8亿个·mL-1，与模型预测值基本相符，比基础培养基提高了72%，对全蚀病菌抑制率达到87.2%，较优化前提高了32.5%。
3 结论与讨论
小麦全蚀病是小麦上的一种毁灭性病害，民间俗称“小麦癌症”。 枯草芽孢杆菌YB-81菌株经过室内生测、盆栽试验、田间试验已验证其对小麦全蚀病有较好的抑制作用，同时通过拌种处理，菌株进入土壤，能够改善土壤环境，对小麦全蚀病的长期预防与防治大有益处。目前该菌株专利已授权（专利号2010101 99739.1）。利用该生防菌株研发的微生物菌剂已经得到了农业部农药大田试验批准证书（农药试验证号：SY201001691），已完成农药大田试验，正在登记，该菌株在生产上的应用前景广泛。
在大规模生产菌剂前，对菌株YB-81的发酵条件进行优化，能够确定一套产率最大、最节约的发酵模式。传统上对于生防菌株的发酵通常采用单因素试验和正交试验相结合的方法[7-11]，本研究在单因素试验基础上采用响应面分析法对试验结果进行数学模拟和优化，直观、可信度高[12]，最终确定了一系列最优发酵条件，使其对小麦全蚀病菌的抑制率提高32.5%，菌落总数提高72%。
本试验中对生防菌株的发酵优化是在摇瓶发酵的基础上进行的，当菌株进一步中试生产时，可以此发酵模式为基础，但发酵罐中的发酵条件还需进一步的验证及研究。
参考文献：
[1] 高照良， 商鸿生. 小麦全蚀病发病因素研究进展[J]. 麦类作物学报， 1999， 19（6）： 63-65.
[2] 司剑林. 小麦全蚀病的发生规律及防治技术[J]. 现代农业科技， 2009 （16）： 135-135.
[3] James C R. Review Take-all of wheat [J]. Physiological and Molecular Plant Pathology，2003， 62： 73-86.
[4] 王翠，燕照玲，施艳，等.河南省小麦全蚀病菌变种类型鉴定[J]. 河南农业科学，2013（5）： 97-100.
[5] 李华. 平板菌落计数的改进方法[J]. 生物学通报， 2006，41（1）： 51-51.
[6] 孙广宇， 宗兆峰. 植物病理学实验技术[M]. 北京：中国农业出版社， 2002： 142-143.
[7] Ing-Lung Shih， Chia-Yu Kuo， Feng-Chia Hsieh， et al.Use of surface response methodology to optimize culture conditions for iturin A production by Bacillus subtilis in solid-state fermentation[J]. Journal of the Chinese Institute of Chemical Engineers， 2008， 39（6）： 635-643.
[8] Li Rui-fang，XU Yi. Fermentation optimization to improve production of antagonistic metabites by Bacillus subtilis strain BS501a[J]. Journal of Central South university， 2011，18（4）：1 047-1 053.
[9] 陆继臣，迟乃玉，窦少华，等. 响应面法优化灰霉病生防菌CNY-04培养条件[J]. 微生物学通报， 2013， 40（8）： 1 414-1 422.
[10] 曹冬梅，胡耀辉. 基于响应面法优化HY15发酵生产β-环糊精葡萄糖基转移酶的发酵条件[J]. 东北林业大学学报， 2012， 40（1）： 97-100.
[11] 孙会强，周赛男，谭周进， 等. 一株烟草内生拮抗放线菌发酵条件优化[J]. 应用与环境生物学报， 2011， 17（6）： 914-917.
[12] 张文芝，郭坚华. 微生物发酵工艺优化研究进展[J]. 广东农业科学， 2013，40（6）： 114-117.
关键词：小麦全蚀病；生防菌；响应面法；发酵
中图分类号： S476.1 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.09.013
Abstract： In order to raising the antagonistic effect， the growth conditions and culture medium of biocontrol strain YB-81 was optimized based on single factor test. The optimal culture conditions of the biocontrol strain YB-81 were determined for 0.53% beef extract+glucose（1∶1）， 0.99% peptone， 0.20% odium chloride， temperature at 36 ℃， pH 8.0， speeding at 200 r·min-1， the incubation time of 36 h. The total numbers of colony was 1.88×109·mL-1， improving by 72%， and the inhibition rate to Gaeumannomyces gramims was 87.2%， improving by 32.5% with the optimal growth conditions. The optimal growth condition of the biocontrol strain YB-81 was identified， providing a theoretical basis for enlargement of production.
Key words： wheat take-all；biocontrol strain；response surface methodology；fermentation
小麦全蚀病（Wheat take-all）是一种典型的根部土传病害，由子囊菌亚门的禾顶囊壳菌小麦变种（Gaeumannomyces gramims var. tritici）侵染所致[1-4]。小麦发病后，植株根部变黑，分蘖减少，成穗率降低，千粒质量下降，甚至全株枯死，减产幅度很大，民间称此病害为“小麦癌症”。最近5年，小麦全蚀病扩展迅速，造成严重危害， 且防控困难已经成为一种非常顽固的土传病害。目前，对全蚀病的防治依靠化学药剂拌种，常规药剂防治效果不好，全蚀净防效较好但成本太高。
YB-81菌株是河南省农业科学院植物保护研究所利用现代微生物筛选和分子生物学技术培育出的对小麦全蚀病具有高效抑制作用的枯草芽孢杆菌，通过室内生测试验以及田间试验证明对小麦全蚀病菌有较好的防治作用，目前该菌株专利已授权（专利号2010101 99739.1）。本试验采用响应面法优化了该菌株的发酵条件，目的是为提高该菌株的防病效果，进一步中试生产，为应用于大田提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 材 料
供试菌株及培养基：枯草芽孢杆菌YB-81和小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces gramims var. tritici）均由河南省农业科学院植物保护研究所提供。基础培养基为NA培养基，小麦全蚀病菌培养基为PDA。
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1.2.2 抑菌率测定 抑菌率的测定采用含毒介质法[6]。
1.2.3 发酵条件优化 通过单因素试验，测定不同时间、温度、初始pH值、药瓶转速对YB-81菌株发酵效果的影响。
1.2.4 响应面优化试验 响应面法优化发酵培养基试验设计，选取对发酵培养基有显著影响的3个因素即碳源、氮源及无机离子，采用单因素试验方法确定3个因素的试验点，每个因素选择2个水平，测定各发酵培养基中芽孢杆菌的生长量。在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken中心组合设计原理，选取碳源牛肉膏+葡萄糖（1∶1） （g）、氮源蛋白胨（g）、无机离子氯化钠（g）3个因素来研究发酵培养基最佳条件，以菌落总数为响应值，利用Design-Exper.8.05软件设计了3因素3水平的响应面试验（表1）。
2 结果与分析
2.1 最优发酵条件
通过设置不同时间、温度、初始pH值、摇瓶转速优化菌株YB-81的发酵条件，结果如图1～图4所示。菌落总数与抑菌率的变化趋势基本一致，菌落总数越高，抑菌率也越高。发酵时间36 h抑制率达最高80.6%，菌落总数16.6亿个·mL-1；随着发酵温度的上升菌落总数逐渐增多，在36 ℃时发酵代谢物此时的抑菌作用最强，菌落生长总数也最多，40 ℃ 时抑制率明显降低；pH值8.0时，抑制率和菌落总数均在最高点，与其他处理差异显著；芽孢杆菌在5个不同摇床转速条件下，抑制率变化不明显，菌落总数逐渐增多，在200 r·min-1菌落总数达到最大值16.2亿个·mL-1。 2.2 生防芽孢杆菌YB-81发酵培养基试验设计
通过单因素试验，得出发酵培养基（100 mL）中最佳碳源葡萄糖+牛肉膏（1∶1）添加量为0.5 g，最佳氮源蛋白胨1.0 g，最佳无机离子氯化钠0.20 g。
2.3 响应面法优化培养基
2.3.1 响应面优化试验 以菌落总数为响应值，利用Design-Exper.8.05软件设计了3因素3水平的响应面试验，菌落总数响应曲面分析试验结果见表2。
根据软件对表2中试验结果进行多元回归拟合，得到生防芽孢杆菌培养基设计过程中A碳源、B氮源、C无机离子的二次多项回归模型：
Y=+177.60+2.00A-5.88B+1.62C+9.75AB+0.25AC-1.50BC-88.30A2-27.05B2-45.55C2
2.3.2 响应曲面方差分析 通过表3可以看出，该模型的F值为38.03说明模型是显著的，各因素中BC和B2显著；均二次方A2、C2极显著。
2.3.3 响应曲面图与等高值线图的分析 交互效应的强弱可用等高线的形状来映出， 椭圆形表示两因素交互作用显著， 而圆形则与之相反。由图4～图6可知，碳源葡萄糖+牛肉膏（1∶1）（A）、氮源蛋白胨（B）、无机离子氯化钠（C）之间的相互作用对菌落总数的影响。
如图中4所示，碳源与氮源之间存在交互作用，当碳源在零水平时，在氮源增加的同时，菌落总数也逐渐增加，当碳源超过0.5 g以后，菌落总数不再增加。从等高线图中可直观看出两因素交互作用不显著。
图5显示了碳源与无机离子之间交互作用不显著，从其等高线可直观看出，因为等高线的形状反应了交互效应的强弱大小，圆形表示两个因素作用不显著。
由图6可知，把氮源加入量固定于零水平（1.0 g）时，氮源与培养基中无机离子交互影响效应特点是：随着氮源的变化，菌落总数先上升后降低；适当的增加氮源可以减少一定量无机离子。说明氮源与无机离子有一定的交互作用。
以上3个响应面均为开口向下，说明响应值（菌落总数）存在极大值，3个图形的等高线中心均位于-1～1之间，表明培养基最优条件存在于所设计的因素水平范围之内。模型培养基优化条件为：碳源0.53 g，氮源0.99 g， 无机离子0.20 g，在此条件下，模型预测菌落总数为168.408 ×107个·mL-1。
2.3.4 模型验证 通过Plackett-Burman试验设计筛选出全蚀病生防菌株YB-81发酵培养基的3个影响因素，模型理论条件牛肉膏+葡萄糖（1∶1）0.53%，蛋白胨0.99%，氯化钠0.20%，这3个主要因素对菌株YB-81生长条件存在显著影响。在此条件下进行验证试验，经3次平行验证试验，取平均值，实际菌落总数为18.8亿个·mL-1，与模型预测值基本相符，比基础培养基提高了72%，对全蚀病菌抑制率达到87.2%，较优化前提高了32.5%。
3 结论与讨论
小麦全蚀病是小麦上的一种毁灭性病害，民间俗称“小麦癌症”。 枯草芽孢杆菌YB-81菌株经过室内生测、盆栽试验、田间试验已验证其对小麦全蚀病有较好的抑制作用，同时通过拌种处理，菌株进入土壤，能够改善土壤环境，对小麦全蚀病的长期预防与防治大有益处。目前该菌株专利已授权（专利号2010101 99739.1）。利用该生防菌株研发的微生物菌剂已经得到了农业部农药大田试验批准证书（农药试验证号：SY201001691），已完成农药大田试验，正在登记，该菌株在生产上的应用前景广泛。
在大规模生产菌剂前，对菌株YB-81的发酵条件进行优化，能够确定一套产率最大、最节约的发酵模式。传统上对于生防菌株的发酵通常采用单因素试验和正交试验相结合的方法[7-11]，本研究在单因素试验基础上采用响应面分析法对试验结果进行数学模拟和优化，直观、可信度高[12]，最终确定了一系列最优发酵条件，使其对小麦全蚀病菌的抑制率提高32.5%，菌落总数提高72%。
本试验中对生防菌株的发酵优化是在摇瓶发酵的基础上进行的，当菌株进一步中试生产时，可以此发酵模式为基础，但发酵罐中的发酵条件还需进一步的验证及研究。
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[12] 张文芝，郭坚华. 微生物发酵工艺优化研究进展[J]. 广东农业科学， 2013，40（6）： 114-117.