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摘 要 目的：考察七參连湿疹膏对特应性皮炎（AD）模型豚鼠的改善作用，并探讨其可能机制。方法：将雌性豚鼠随机分为正常对照组，模型对照组，基质对照组（七参连湿疹膏基质，1 g/kg），七参连湿疹膏低、中、高剂量组（0.5、1、2 g/kg）和丁酸氢化可的松乳膏组（0.5 g/kg），每组10只。以卵清蛋白为抗原，激发豚鼠皮肤变态反应以复制AD模型。末次激发48 h后，正常对照组和模型对照组豚鼠涂以生理盐水，基质对照组豚鼠涂以七参连湿疹膏基质，各给药组豚鼠涂以相应药物；每天2次，连续14 d。记录各组豚鼠给药前后的红斑、水肿、抓痕等症状评分；采用苏木精-伊红染色法观察豚鼠皮肤组织形态学特征；采用TUNEL法检测豚鼠皮肤组织角质形成细胞凋亡情况；采用酶联免疫吸附测定法检测豚鼠皮肤组织干扰素γ（IFN-γ）水平。结果：与正常对照组比较，模型对照组和基质对照组豚鼠皮肤组织中均可见炎症细胞浸润、表皮角化过度、棘层增厚等症状，其红斑、水肿、抓痕评分及总评分和皮肤组织中IFN-γ水平均显著升高，角质形成细胞凋亡数均显著减少（P<0.01）。与模型对照组和基质对照组比较，各给药组豚鼠上述症状均有不同程度的减轻，其中各给药组豚鼠给药后的红斑、水肿、抓痕评分及总评分以及七参连湿疹膏中、高剂量组和丁酸氢化可的松乳膏组豚鼠皮肤组织中IFN-γ水平均显著降低，且给药组上述评分均显著低于同组给药前（P<0.05或P<0.01）；各给药组豚鼠角质形成细胞凋亡数均显著增加（P<0.05或P<0.01）。结论：七参连湿疹膏对AD模型豚鼠具有一定的改善作用，这种作用可能与促进角质形成细胞凋亡、降低皮肤组织INF-γ水平有关。
关键词 七参连湿疹膏；特应性皮炎；症状评分；角质形成细胞；干扰素γ；豚鼠；机制
Study on Improvement Effects of Qishenlian Eczema Cream on the Atopic Dermatitis Model Guinea Pigs
YAO Rongcheng1，LIU Tao2，HE Bo3，YANG Renhua3，SHEN Zhiqiang3，CHEN Peng3（1. Dept. of Drug and Equipment， Qujing First People’s Hospital， Yunnan Qujing 655000， China； 2. Dept. of Pharmacy， Honghe Vocational College of Health， Yunnan Honghe 661100， China； 3. Pharmaceutical College ， Kunming Medical University/Yunnan Province Key Lab of Pharmacology for Natural Products， Kunming 650500， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the improvement effects of Qishenlian eczema cream on the atopic dermatitis （AD） model guinea pigs， and to investigate its possible mechanism. METHODS： Female guinea pigs were randomly divided into normal control group， model control group， matrix control group （Qishenlian eczema cream matrix， 1 g/kg）， Qishenlian eczema cream low-dose， medium-dose and high-dose groups （0.5， 1， 2 g/kg） and Hydrocortisone butyrate cream group （0.5 g/kg）， with 10 guinea pigs in each group. Using ovalbumin as antigen， the skin allergy of guinea pigs was stimulated to induce AD model. Forty-eight hours after the last excitation， guinea pigs were smeared with normal saline in normal control group and model control group， while those were smeared with Qishenlian eczema cream matrix in matrix control group， and administration groups were treated with relevant medicine， twice a day， for consecutive 14 d. The scores of erythema， edema and scratch before and after administration were recorded in each group. The morphological characteristics of skin were observed by HE staining. TUNEL method was used to detect the apoptosis of keratinocytes in skin tissue. The level of IFN-γ in skin lesions was detected by ELISA. RESULTS： Compared with normal control group， inflammatory cell infiltration， hyperkeratosis of epidermis and thickening of spinous layer were observed in skin tissue of guinea pigs in model control group and matrix control group； the scores of erythema， edema and scratch and their total score， the level of IFN-γ in skin tissue were increased significantly； the apoptosis number of keratinocytes was decreased significantly （P<0.01）. Compared with model control group and matrix control group， above symptoms of medication groups were relieved to different extents； the scores of erythema， edema and scratch and their total score after medication in medication groups， the level of IFN-γ in skin tissue in Qishenlian eczema cream medium-dose and high-dose groups and Hydrocortisone butyrate cream group were decreased significantly， and above scores in medication groups were significantly lower than before medication （P<0.05 or P<0.01）； the apoptosis number of keratinocytes was increased significantly in medication groups （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Qishenlian eczema cream has certain improvement effect on AD model guinea pigs， the mechanism of which may be associated with promoting the keratinocyte apoptosis， reducing the level of INF-γ in skin tissue. KEYWORDS Qishenlian eczema cream； Atopic dermatitis； Symptom score； Keratinocyte apoptosis； IFN-γ； Guinea pigs； Mechanism
湿疹（Eczema）是皮肤科临床常见的一类变态反应性皮肤病，主要包括变应性接触性皮炎（Allergic contact dermatitis，ACD）、湿疹和特应性皮炎（Atopic dermatitis，AD）。目前，学者普遍认为湿疹是由机体内、外因共同作用所致，且易反复发作[1-2]。其中，AD是由活化的T辅助淋巴细胞2（Th2）、嗜酸性粒细胞和肥大细胞之间复杂的相互作用所导致的，以炎症细胞浸润为主要机制，以反复发作、多形性皮损、皮肤干燥、剧烈瘙痒等为基本临床特征的炎症性皮肤病，其发病可能与遗传因素所致的免疫失常、皮肤屏障功能障碍以及环境因素等密切相关[3-4]。AD的临床治疗主要包括含糖皮质激素、钙调神经磷酸酶抑制剂的外用药物治疗和含抗组胺药、抗炎症介质药物、糖皮质激素及免疫抑制剂的系统治疗[5]。但上述药物可能造成嗜睡、口干、乏力、皮肤色素沉着及皮肤萎缩等不良反应，长期应用可能导致耐药现象的发生，且存在一定的停药反应（如皮损加重、激素依耐性皮炎等），导致其临床应用受到极大限制[6-7]。
中医认为，湿疹的发病主因为“风”“濕”“热”[8-9]。有研究指出，中医药对湿疹的治疗独具优势，能通过多种途径祛风利湿、清热润燥、抗过敏，具有疗效好、副作用少的优点，受到学者的普遍关注[9]。七参连湿疹膏由黄连、苦参、苍术、重楼、三七、白鲜皮、炉甘石、花椒、冰片、甘草等药材组成，具有清热燥湿、活血消肿、祛风止痒之功效，临床用于治疗因风湿热毒瘀阻所致的AD，效果肯定[10-11]，但其基础研究证据有限。为此，本研究以卵清蛋白（OVA）诱导的AD模型豚鼠为对象，对七参连湿疹膏的药效学进行评价，并探索其可能的作用机制，旨在为该药的临床应用及机制明确提供实验依据。
1 材料
1.1 仪器
MK3型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；RM2235型石蜡切片机（德国Leica公司）；CX21 FS1型光学显微镜（日本Olympus公司）；03024R型高速冷冻型离心机（美国Scilogex公司）；Scientz-950E型超声波破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）。
1.2 药品与试剂
七参连湿疹膏（批准文号：国药准字B20020421，批号：20160402，规格：15 g/支）；七参连湿疹膏基质（由氢氧化钾、三乙醇胺、乙醇、硬脂酸、甘油、硬脂醇、液体石蜡等组成，批号：20160402）均购自云南蓝绿康药业有限公司；丁酸氢化可的松乳膏[阳性对照，天津金辉药业有限公司，批准文号：国药准字H10940095，批号：20151002，规格：0.1%（10 g ∶ 10 mg）]；OVA（中国医药集团上海化学试剂公司，批号：F20010702，纯度：98%）；干扰素γ（IFN-γ）酶联免疫吸附测定（ELISA）检测试剂盒（美国RayBiotech公司，批号：0828150131）；TUNEL试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号：07E16BM）；十二烷基硫酸钠（SDS）（美国Amresco公司，批号：151-21-3）；医用白凡士林（甘肃润康药业有限公司，批号：20140604）；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（北京雷根生物技术有限公司，批号：201550730）；DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：60882801）；RIPA裂解液（碧云天生物技术公司，批号：P0013B）；其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
1.3 动物
普通级雌性豚鼠，2月龄，体质量320～350 g，由昆明医科大学提供，动物生产许可证号：SCXK（滇）K2015-0005。所有动物均于通风环境中饲养，自由饮食饮水，适应性饲养1周后进行后续实验。
2 方法
2.1 分组、造模与给药
将豚鼠随机分为正常对照组，模型对照组，基质对照组（七参连湿疹膏基质，1 g/kg），七参连湿疹膏低、中、高剂量组[0.5、1、2 g/kg；剂量根据本课题组前期皮肤刺激性和过敏性试验结果（安全剂量≤2 g/kg）设定]和丁酸氢化可的松乳膏组（0.5 g/kg；该药药品说明书并未注明外用剂量，本研究剂量根据均匀涂满致敏皮肤区域预估），每组10只。除正常对照组外，其余各组豚鼠均按文献[12]方法复制豚鼠AD模型：在每只动物背部两侧去毛，每侧面积约为2 cm×3 cm。豚鼠腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）进行麻醉，在左侧去毛处皮内注射OVA-氢氧化铝溶液（每10 mL生理盐水中含OVA 10 μg、氢氧化铝0.5 mg）100 μL。注射1周后，用纱布（3 cm×4 cm）将10%OVA+10%SDS+30%凡士林+50%水（g/mL，下同）敷于去毛处，保持48 h；注射后3周后，用纱布（3 cm×4 cm）将10%OVA+5%SDS+37%凡士林+48%水敷于去毛处，保持48 h；休息1周后，用双层纱布（1 cm×1 cm）将10%OVA+70%凡士林+20%水敷于去毛处，保持24 h，进行抗原激发反应。右侧去毛处用不含OVA、SDS、氢氧化铝、凡士林的湿纱布同法处理，作为自身对照。末次激发48 h后，对致敏的左侧皮肤进行处理：正常对照组和模型对照组豚鼠均涂以生理盐水（1 mL/kg），基质对照组豚鼠涂以七参连湿疹膏基质，各给药组豚鼠均涂以相应药物；每天2次，连续14 d。
2.2 症状评分
造模后，分别于给药前后按如下标准对各组豚鼠致敏侧的皮肤症状进行评分[12]——（1）红斑：无为0分，轻微红斑为1分，明显红斑但无痂皮为2分，中、重度红斑伴轻、中度痂皮为3分，重度红斑伴重度痂皮为4分；（2）水肿：无为0分，轻度为1分，中、重度为2分；（3）抓痕：无为0分，有为1分。总评分为上述各项评分之和。
关键词 七参连湿疹膏；特应性皮炎；症状评分；角质形成细胞；干扰素γ；豚鼠；机制
Study on Improvement Effects of Qishenlian Eczema Cream on the Atopic Dermatitis Model Guinea Pigs
YAO Rongcheng1，LIU Tao2，HE Bo3，YANG Renhua3，SHEN Zhiqiang3，CHEN Peng3（1. Dept. of Drug and Equipment， Qujing First People’s Hospital， Yunnan Qujing 655000， China； 2. Dept. of Pharmacy， Honghe Vocational College of Health， Yunnan Honghe 661100， China； 3. Pharmaceutical College ， Kunming Medical University/Yunnan Province Key Lab of Pharmacology for Natural Products， Kunming 650500， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the improvement effects of Qishenlian eczema cream on the atopic dermatitis （AD） model guinea pigs， and to investigate its possible mechanism. METHODS： Female guinea pigs were randomly divided into normal control group， model control group， matrix control group （Qishenlian eczema cream matrix， 1 g/kg）， Qishenlian eczema cream low-dose， medium-dose and high-dose groups （0.5， 1， 2 g/kg） and Hydrocortisone butyrate cream group （0.5 g/kg）， with 10 guinea pigs in each group. Using ovalbumin as antigen， the skin allergy of guinea pigs was stimulated to induce AD model. Forty-eight hours after the last excitation， guinea pigs were smeared with normal saline in normal control group and model control group， while those were smeared with Qishenlian eczema cream matrix in matrix control group， and administration groups were treated with relevant medicine， twice a day， for consecutive 14 d. The scores of erythema， edema and scratch before and after administration were recorded in each group. The morphological characteristics of skin were observed by HE staining. TUNEL method was used to detect the apoptosis of keratinocytes in skin tissue. The level of IFN-γ in skin lesions was detected by ELISA. RESULTS： Compared with normal control group， inflammatory cell infiltration， hyperkeratosis of epidermis and thickening of spinous layer were observed in skin tissue of guinea pigs in model control group and matrix control group； the scores of erythema， edema and scratch and their total score， the level of IFN-γ in skin tissue were increased significantly； the apoptosis number of keratinocytes was decreased significantly （P<0.01）. Compared with model control group and matrix control group， above symptoms of medication groups were relieved to different extents； the scores of erythema， edema and scratch and their total score after medication in medication groups， the level of IFN-γ in skin tissue in Qishenlian eczema cream medium-dose and high-dose groups and Hydrocortisone butyrate cream group were decreased significantly， and above scores in medication groups were significantly lower than before medication （P<0.05 or P<0.01）； the apoptosis number of keratinocytes was increased significantly in medication groups （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Qishenlian eczema cream has certain improvement effect on AD model guinea pigs， the mechanism of which may be associated with promoting the keratinocyte apoptosis， reducing the level of INF-γ in skin tissue. KEYWORDS Qishenlian eczema cream； Atopic dermatitis； Symptom score； Keratinocyte apoptosis； IFN-γ； Guinea pigs； Mechanism
湿疹（Eczema）是皮肤科临床常见的一类变态反应性皮肤病，主要包括变应性接触性皮炎（Allergic contact dermatitis，ACD）、湿疹和特应性皮炎（Atopic dermatitis，AD）。目前，学者普遍认为湿疹是由机体内、外因共同作用所致，且易反复发作[1-2]。其中，AD是由活化的T辅助淋巴细胞2（Th2）、嗜酸性粒细胞和肥大细胞之间复杂的相互作用所导致的，以炎症细胞浸润为主要机制，以反复发作、多形性皮损、皮肤干燥、剧烈瘙痒等为基本临床特征的炎症性皮肤病，其发病可能与遗传因素所致的免疫失常、皮肤屏障功能障碍以及环境因素等密切相关[3-4]。AD的临床治疗主要包括含糖皮质激素、钙调神经磷酸酶抑制剂的外用药物治疗和含抗组胺药、抗炎症介质药物、糖皮质激素及免疫抑制剂的系统治疗[5]。但上述药物可能造成嗜睡、口干、乏力、皮肤色素沉着及皮肤萎缩等不良反应，长期应用可能导致耐药现象的发生，且存在一定的停药反应（如皮损加重、激素依耐性皮炎等），导致其临床应用受到极大限制[6-7]。
中医认为，湿疹的发病主因为“风”“濕”“热”[8-9]。有研究指出，中医药对湿疹的治疗独具优势，能通过多种途径祛风利湿、清热润燥、抗过敏，具有疗效好、副作用少的优点，受到学者的普遍关注[9]。七参连湿疹膏由黄连、苦参、苍术、重楼、三七、白鲜皮、炉甘石、花椒、冰片、甘草等药材组成，具有清热燥湿、活血消肿、祛风止痒之功效，临床用于治疗因风湿热毒瘀阻所致的AD，效果肯定[10-11]，但其基础研究证据有限。为此，本研究以卵清蛋白（OVA）诱导的AD模型豚鼠为对象，对七参连湿疹膏的药效学进行评价，并探索其可能的作用机制，旨在为该药的临床应用及机制明确提供实验依据。
1 材料
1.1 仪器
MK3型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；RM2235型石蜡切片机（德国Leica公司）；CX21 FS1型光学显微镜（日本Olympus公司）；03024R型高速冷冻型离心机（美国Scilogex公司）；Scientz-950E型超声波破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）。
1.2 药品与试剂
七参连湿疹膏（批准文号：国药准字B20020421，批号：20160402，规格：15 g/支）；七参连湿疹膏基质（由氢氧化钾、三乙醇胺、乙醇、硬脂酸、甘油、硬脂醇、液体石蜡等组成，批号：20160402）均购自云南蓝绿康药业有限公司；丁酸氢化可的松乳膏[阳性对照，天津金辉药业有限公司，批准文号：国药准字H10940095，批号：20151002，规格：0.1%（10 g ∶ 10 mg）]；OVA（中国医药集团上海化学试剂公司，批号：F20010702，纯度：98%）；干扰素γ（IFN-γ）酶联免疫吸附测定（ELISA）检测试剂盒（美国RayBiotech公司，批号：0828150131）；TUNEL试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号：07E16BM）；十二烷基硫酸钠（SDS）（美国Amresco公司，批号：151-21-3）；医用白凡士林（甘肃润康药业有限公司，批号：20140604）；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（北京雷根生物技术有限公司，批号：201550730）；DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：60882801）；RIPA裂解液（碧云天生物技术公司，批号：P0013B）；其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
1.3 动物
普通级雌性豚鼠，2月龄，体质量320～350 g，由昆明医科大学提供，动物生产许可证号：SCXK（滇）K2015-0005。所有动物均于通风环境中饲养，自由饮食饮水，适应性饲养1周后进行后续实验。
2 方法
2.1 分组、造模与给药
将豚鼠随机分为正常对照组，模型对照组，基质对照组（七参连湿疹膏基质，1 g/kg），七参连湿疹膏低、中、高剂量组[0.5、1、2 g/kg；剂量根据本课题组前期皮肤刺激性和过敏性试验结果（安全剂量≤2 g/kg）设定]和丁酸氢化可的松乳膏组（0.5 g/kg；该药药品说明书并未注明外用剂量，本研究剂量根据均匀涂满致敏皮肤区域预估），每组10只。除正常对照组外，其余各组豚鼠均按文献[12]方法复制豚鼠AD模型：在每只动物背部两侧去毛，每侧面积约为2 cm×3 cm。豚鼠腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）进行麻醉，在左侧去毛处皮内注射OVA-氢氧化铝溶液（每10 mL生理盐水中含OVA 10 μg、氢氧化铝0.5 mg）100 μL。注射1周后，用纱布（3 cm×4 cm）将10%OVA+10%SDS+30%凡士林+50%水（g/mL，下同）敷于去毛处，保持48 h；注射后3周后，用纱布（3 cm×4 cm）将10%OVA+5%SDS+37%凡士林+48%水敷于去毛处，保持48 h；休息1周后，用双层纱布（1 cm×1 cm）将10%OVA+70%凡士林+20%水敷于去毛处，保持24 h，进行抗原激发反应。右侧去毛处用不含OVA、SDS、氢氧化铝、凡士林的湿纱布同法处理，作为自身对照。末次激发48 h后，对致敏的左侧皮肤进行处理：正常对照组和模型对照组豚鼠均涂以生理盐水（1 mL/kg），基质对照组豚鼠涂以七参连湿疹膏基质，各给药组豚鼠均涂以相应药物；每天2次，连续14 d。
2.2 症状评分
造模后，分别于给药前后按如下标准对各组豚鼠致敏侧的皮肤症状进行评分[12]——（1）红斑：无为0分，轻微红斑为1分，明显红斑但无痂皮为2分，中、重度红斑伴轻、中度痂皮为3分，重度红斑伴重度痂皮为4分；（2）水肿：无为0分，轻度为1分，中、重度为2分；（3）抓痕：无为0分，有为1分。总评分为上述各项评分之和。