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[摘要] 目的 探讨CD40基因单核苷酸多态性及其基因型与下肢动脉硬化闭塞症的相关性。 方法 采用reverse transcription-PCR技术及DNA测序法对经动脉彩色多普勒检查诊断为下肢动脉硬化闭塞症的201例患者（病例组）及健康体检中未发现下肢动脉硬化闭塞症的198例健康人（对照组）进行检测分析，比较CD40基因rs1883 832C/T单核苷酸多态性及其基因型与下肢动脉硬化闭塞症的相关性。 结果 下肢动脉硬化闭塞症组与健康对照组CD40基因rs1883832C/T位点中CC基因相比，差异有统计学意义（χ2=7.380，P=0.007）；通过等位基因频率的危险性评估发现，C基因携带者患下肢动脉硬化闭塞症的风险是T基因携带者的1.304倍（OR=1.304）。 结论 CD40基因多态性位点rs1883832C/T与下肢动脉硬化闭塞症的发病显著相关，其中C等位基因可能是该疾病的危险因素。
[关键词] 基因；等位基因；动脉粥样硬化；单核苷酸多态性
[中图分类号] RR543.5；R440 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）36-0026-03
[Abstract] Objective To investigate the correlation between single nucleotide polymorphisms of CD40 gene as well as its genotype and arteriosclerosis obliterans of lower extremities. Methods 201 patients who were diagnosed with arteriosclerosis obliterans by arterial color Doppler ultrasonography examination（case group） and 198 cases of healthy patients who were not found lower extremity arteriosclerosis obliterans in health examination（control group） were detected and analyzed by use of reverse transcription-PCR and DNA sequencing. The correlation between CD18 gene rs1883832C/T single nucleotide polymorphisms as well as their genotype and lower extremity arteriosclerosis obliterans were compared. Results CC gene in CD40 gene rs1883832C/T locus of the case group was significantly different from that of the control group（χ2=7.380， P=0.007）. Through the risk assessment of allele frequency， it was found that the risk of atherosclerotic occlusive disease in C gene carriers was 1.304 times that of T gene carriers（OR=1.304）. Conclusion CD40 gene polymorphic locus 1883832C/T was significantly associated with the development of lower extremity arteriosclerosis obliterans， in which C allele may be a risk factor for the disease.
[Key words] Gene； Allele； Atherosclerosis； Single nucleotide polymorphism
下肢動脉硬化闭塞症是全身动脉粥样硬化在下肢动脉的表现，是反应全身动脉粥样硬化的一个窗口，通常发生在40岁以上人群中，随着年龄增加而逐渐加重[1]，常因动脉内膜增厚、管腔狭窄或闭塞导致间歇性跛行、患肢皮温低、疼痛甚至发生溃疡或肢体坏死[2]。近年来，越来越多的研究显示，动脉粥样硬化是动脉内膜发生了炎症性质的改变，而CD40基因可以对炎症反应进行激活，从而促进动脉内膜的炎症改变的发生[3，4]，为了探讨CD40基因与下肢动脉硬化闭塞症之间的关系，本文采用reverse transcription-PCR技术及DNA测序法对201例下肢动脉硬化闭塞症患者及198例健康人进行检测，通过对两组人群进行比较，探讨 CD40基因单核苷酸多态性及其基因型与下肢动脉硬化闭塞症的相关性，为基因与表型之间的联系提供现实依据，为进一步研究下肢动脉硬化闭塞症的发病机制提供线索。
1资料与方法
1.1一般资料
选择2014年1月～2016年5月间于我院住院就诊的下肢动脉硬化闭塞症的201例患者为病例组，其中男123例，女78例，平均年龄（63.2±15.1）岁，另选择2015年5月～2015年8月间来我院健康体检的40岁以上健康人198例为对照组，其中男105例，女93例，平均年龄（64.7±18.3）岁。病例组与对照组在年龄、性别等方面均衡可比。
1.2纳入及排除标准
纳入标准：病例组患者均符合2011年卫生部颁布的下肢动脉硬化闭塞症诊断标准（WS 339-2011），所有纳入的人群均不合并血管栓塞性疾病、血管炎性疾病及肿瘤、自身免疫性疾病；排除标准：发生过血栓闭塞性脉管炎、多发性大动脉炎、结节性动脉周围炎、特发性动脉血栓形成以及急性下肢动脉栓塞的患者；拒绝进行本次研究的患者。 1.3研究方法
采用reverse transcription-PCR技术及DNA测序法检测目的基因的多态性。
1.3.1 RNA的提取 在调查对象全血中收集单个核细胞，采用改良酸性硫氰酸胍-酚-氯仿提取法（TRIzol法）提取单核细胞基因组RNA[5]，然后将提取的RNA逆转录成c-DNA保存于-80℃冰箱中备用。
1.3.2 引物的设计 采用primer premier5引物设计软件设计CD40基因rs1883832C/T基因序列的扩增引物。首先在NCBI的基因库中查找该基因的基因序列，复制序列至primer premier5软件，设置参数，引物长度一般设置成18～30 bp，扩增片段长度设置成100～600 bp。设计完成后采用Oligo 6.0软件对引物进行验证评估。
1.3.3 引物的合成 采用分子量标准引物定位合成法（marker primer-directed synthesis，MPDS）[6]合成以上软件设计的引物，其中，rs1883832C/T位点碱基的DNA片段正向引物序列为5’-GGACCTGGGGG-CAAAGAAGA-3’，反向引物序列为5’-CCCACTCCCAAC-TCCCGTCT -3’。
1.3.4 PCR扩增 该CD40基因单核苷酸的PCR扩增体系共50 μL，具体反应体系成分及扩增程序见表1、2。CD40基因单核苷酸多态性分型用Genemapper4.0进行分析。
1.4统计学方法
CD40基因各多态性位点基因型和等位基因频率采用直接计数法计算，病例组与对照组两组之间基因型及等位基因频率的比较采用χ2检验，对于其中单个基因是否是导致该病的危险因素采用OR（比值比）进行计算，OR值>1表示该因素是危险因素；OR值<1，表示该因素是保护因素。采用SPSS19.0软件对数据进行计算和比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CD40基因单核苷酸多态性位点基因型
CD40基因rs1883832C/T位点PCR扩增产物片段大小为374 bp。根据单核苷酸多态性分型结果，CD40基因单核苷酸多态性位点基因型均为CC型、CT型以及TT型。
2.2 病例组与对照组CD40基因多态性的差异
经过Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，本实验所纳入的两组人群中CD40基因型分布频率与现实人群分布一致，处于遗传平衡状态，具有群体代表性。下肢动脉硬化闭塞症组与健康对照组CD40基因rs1883832C/T位点，CC、TT基因型和C、T等位基因频率比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。其中，C基因携带者患下肢动脉硬化闭塞症的风险是T基因携带者的1.304倍（OR=1.304）。见表3。
3 讨论
隨着年龄的增长，下肢动脉硬化闭塞症的发病率逐年提高，带给人们的健康危害也越来越大。据报道，国外75岁以上人群中患病率接近20%[7-9]，在我国，老年人群中下肢动脉硬化闭塞症的患病率高达10% 以上[10]。同时，相应的流行病学调查显示，在进行下肢截肢的患者中约有40%～60%是因为发生了下肢动脉硬化闭塞症[11]，即便能够保留下肢，对于下肢动脉硬化闭塞症的患者而言，其自己本身的生活质量也不高。因此，关于下肢动脉硬化闭塞症的病因学研究也显得愈加重要。越来越多的有关动脉硬化相关疾病与基因间的关系的研究证实基因层面的病因才是导致该疾病发生的主要原因[12]。而进行年来，越来越多的研究表明造成动脉粥样硬化的最主要原因是因为慢性炎症性质的改变，在最近的基因与疾病的相关性研究中，有学者研究发现，表达多种细胞的肿瘤坏死因子受体超家族成员CD40的多态性与血管硬化性疾病的发生具有相关性，以往的研究显示正常的动脉内并不存在CD40L，仅仅只存在CD40，但是在存在着动脉粥样硬化内皮细胞中CD40L与CD40均存在。而进一步的研究证明，一旦位于血管平滑肌内的CD40L被激活，会使得细胞外间质胶原纤维的降解增大，从而使得动脉血管内斑块的不稳定性增加，进一步加速下肢动脉硬化闭塞症的发生[13]。
本病例对照研究中，下肢动脉硬化闭塞症组在rs1883832C/T位点上CC等位基因的频率要显著高于与健康对照组（P<0.05）。同时，我们发现rs1883832C基因携带者患下肢动脉硬化闭塞症的风险是T基因携带者的1.304倍（OR=1.304）。上述研究结果表明：CD40基因多态性位点rs1883832C/T与下肢动脉硬化闭塞症的发病显著相关，其中C等位基因可能是该疾病的危险因素。这一研究结果也与国内外相关的研究结果相印证。国内学者的研究发现，CD40的多态性可影响CD40基因及蛋白表达，进而对于CD40相关疾病的发展和转归都能发生相应的影响[12]，结合本次实验结果，我们认为CD40基因rs1883832C/T位点C基因在下肢动脉硬化闭塞症的发病中起到重要作用， C等位基因可能通过促进CD40基因多态性的表达而促进下肢动脉硬化闭塞症的发病。在现代的研究中相关的学者目前在动脉粥样硬化的基础研究中已经达成共识，即动脉粥样硬化为“炎症损伤反应”机制下的一个产物。而CD40可以通过对于MCP-1的表达进行上调，从而促进血管平滑肌的细胞分裂增殖，同时还能使原本处于静止状态的位于中层的平滑肌细胞进行迁移，往内膜处进行迁移，最终形成纤维性斑块。同时CD40不断的增加炎症因子的释放，导致了血管内皮的损伤，并且发生沉积反应，最后激活CD40基因，使得免疫细胞大量的聚集，发生一系列相关的反应后最终导致了动脉粥样硬化的形成[14，15]。
本研究结果提示CD40基因多态性与下肢动脉硬化闭塞症之间具有相关性，但基因与该疾病之间的具体分子生物学机制以及CD40基因在下肢动脉硬化闭塞症发病中所占的比重仍然未知，要真正搞清这些问题，在基因角度上提出疾病预防的依据，仍然需要大样本、多中心的随机对照研究的印证。 [参考文献]
[1] 章森苗. 经腘动脉入路逆行内膜下血管成形术治疗股浅动脉长段硬化性闭塞症的临床研究[J]. 中国普通外科杂志，2015，26（6）：818-822.
[2] 中华医学会外科学分会血管外科学组. 下肢动脉硬化闭塞症诊疗指南[J]. 中华医学杂志，2015，95（24）：1883-1896.
[3] Shamsara J，Mohammadpour AH，Behravan J，et al. Pentoxifylline decreases soluble CD40 ligand concentration and CD40 gene expression in coronary artery disease patients[J]. Immunopharmacology and Immunotoxicology，2012， 34（3）：523-529.
[4] Pamukcu B，Lip GY，Snezhitskiy V，et al. The CD40-CD40L system in cardiovascular disease[J]. Annals of Medicine，2011，43（5）：331-340.
[5] 程斌，鐘里科，王增，等. 从肺癌组织提取高纯度总RNA方法的优化及应用[J]. 中国现代应用药学，2016 ，33（5）：539-543.
[6] 崔映宇，范海燕，等. 一种分子量标准的引物定位合成[J].阜阳师范学院学报（自然科学版），2000，17（1）：8-11.
[7] Wang M，Li Y，Li W，et al. The CD40 gene polymorphism rs1883832 is associated with risk of acute coronary syndrome in a Chinese case-control study[J]. Dna
[关键词] 基因；等位基因；动脉粥样硬化；单核苷酸多态性
[中图分类号] RR543.5；R440 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）36-0026-03
[Abstract] Objective To investigate the correlation between single nucleotide polymorphisms of CD40 gene as well as its genotype and arteriosclerosis obliterans of lower extremities. Methods 201 patients who were diagnosed with arteriosclerosis obliterans by arterial color Doppler ultrasonography examination（case group） and 198 cases of healthy patients who were not found lower extremity arteriosclerosis obliterans in health examination（control group） were detected and analyzed by use of reverse transcription-PCR and DNA sequencing. The correlation between CD18 gene rs1883832C/T single nucleotide polymorphisms as well as their genotype and lower extremity arteriosclerosis obliterans were compared. Results CC gene in CD40 gene rs1883832C/T locus of the case group was significantly different from that of the control group（χ2=7.380， P=0.007）. Through the risk assessment of allele frequency， it was found that the risk of atherosclerotic occlusive disease in C gene carriers was 1.304 times that of T gene carriers（OR=1.304）. Conclusion CD40 gene polymorphic locus 1883832C/T was significantly associated with the development of lower extremity arteriosclerosis obliterans， in which C allele may be a risk factor for the disease.
[Key words] Gene； Allele； Atherosclerosis； Single nucleotide polymorphism
下肢動脉硬化闭塞症是全身动脉粥样硬化在下肢动脉的表现，是反应全身动脉粥样硬化的一个窗口，通常发生在40岁以上人群中，随着年龄增加而逐渐加重[1]，常因动脉内膜增厚、管腔狭窄或闭塞导致间歇性跛行、患肢皮温低、疼痛甚至发生溃疡或肢体坏死[2]。近年来，越来越多的研究显示，动脉粥样硬化是动脉内膜发生了炎症性质的改变，而CD40基因可以对炎症反应进行激活，从而促进动脉内膜的炎症改变的发生[3，4]，为了探讨CD40基因与下肢动脉硬化闭塞症之间的关系，本文采用reverse transcription-PCR技术及DNA测序法对201例下肢动脉硬化闭塞症患者及198例健康人进行检测，通过对两组人群进行比较，探讨 CD40基因单核苷酸多态性及其基因型与下肢动脉硬化闭塞症的相关性，为基因与表型之间的联系提供现实依据，为进一步研究下肢动脉硬化闭塞症的发病机制提供线索。
1资料与方法
1.1一般资料
选择2014年1月～2016年5月间于我院住院就诊的下肢动脉硬化闭塞症的201例患者为病例组，其中男123例，女78例，平均年龄（63.2±15.1）岁，另选择2015年5月～2015年8月间来我院健康体检的40岁以上健康人198例为对照组，其中男105例，女93例，平均年龄（64.7±18.3）岁。病例组与对照组在年龄、性别等方面均衡可比。
1.2纳入及排除标准
纳入标准：病例组患者均符合2011年卫生部颁布的下肢动脉硬化闭塞症诊断标准（WS 339-2011），所有纳入的人群均不合并血管栓塞性疾病、血管炎性疾病及肿瘤、自身免疫性疾病；排除标准：发生过血栓闭塞性脉管炎、多发性大动脉炎、结节性动脉周围炎、特发性动脉血栓形成以及急性下肢动脉栓塞的患者；拒绝进行本次研究的患者。 1.3研究方法
采用reverse transcription-PCR技术及DNA测序法检测目的基因的多态性。
1.3.1 RNA的提取 在调查对象全血中收集单个核细胞，采用改良酸性硫氰酸胍-酚-氯仿提取法（TRIzol法）提取单核细胞基因组RNA[5]，然后将提取的RNA逆转录成c-DNA保存于-80℃冰箱中备用。
1.3.2 引物的设计 采用primer premier5引物设计软件设计CD40基因rs1883832C/T基因序列的扩增引物。首先在NCBI的基因库中查找该基因的基因序列，复制序列至primer premier5软件，设置参数，引物长度一般设置成18～30 bp，扩增片段长度设置成100～600 bp。设计完成后采用Oligo 6.0软件对引物进行验证评估。
1.3.3 引物的合成 采用分子量标准引物定位合成法（marker primer-directed synthesis，MPDS）[6]合成以上软件设计的引物，其中，rs1883832C/T位点碱基的DNA片段正向引物序列为5’-GGACCTGGGGG-CAAAGAAGA-3’，反向引物序列为5’-CCCACTCCCAAC-TCCCGTCT -3’。
1.3.4 PCR扩增 该CD40基因单核苷酸的PCR扩增体系共50 μL，具体反应体系成分及扩增程序见表1、2。CD40基因单核苷酸多态性分型用Genemapper4.0进行分析。
1.4统计学方法
CD40基因各多态性位点基因型和等位基因频率采用直接计数法计算，病例组与对照组两组之间基因型及等位基因频率的比较采用χ2检验，对于其中单个基因是否是导致该病的危险因素采用OR（比值比）进行计算，OR值>1表示该因素是危险因素；OR值<1，表示该因素是保护因素。采用SPSS19.0软件对数据进行计算和比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CD40基因单核苷酸多态性位点基因型
CD40基因rs1883832C/T位点PCR扩增产物片段大小为374 bp。根据单核苷酸多态性分型结果，CD40基因单核苷酸多态性位点基因型均为CC型、CT型以及TT型。
2.2 病例组与对照组CD40基因多态性的差异
经过Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，本实验所纳入的两组人群中CD40基因型分布频率与现实人群分布一致，处于遗传平衡状态，具有群体代表性。下肢动脉硬化闭塞症组与健康对照组CD40基因rs1883832C/T位点，CC、TT基因型和C、T等位基因频率比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。其中，C基因携带者患下肢动脉硬化闭塞症的风险是T基因携带者的1.304倍（OR=1.304）。见表3。
3 讨论
隨着年龄的增长，下肢动脉硬化闭塞症的发病率逐年提高，带给人们的健康危害也越来越大。据报道，国外75岁以上人群中患病率接近20%[7-9]，在我国，老年人群中下肢动脉硬化闭塞症的患病率高达10% 以上[10]。同时，相应的流行病学调查显示，在进行下肢截肢的患者中约有40%～60%是因为发生了下肢动脉硬化闭塞症[11]，即便能够保留下肢，对于下肢动脉硬化闭塞症的患者而言，其自己本身的生活质量也不高。因此，关于下肢动脉硬化闭塞症的病因学研究也显得愈加重要。越来越多的有关动脉硬化相关疾病与基因间的关系的研究证实基因层面的病因才是导致该疾病发生的主要原因[12]。而进行年来，越来越多的研究表明造成动脉粥样硬化的最主要原因是因为慢性炎症性质的改变，在最近的基因与疾病的相关性研究中，有学者研究发现，表达多种细胞的肿瘤坏死因子受体超家族成员CD40的多态性与血管硬化性疾病的发生具有相关性，以往的研究显示正常的动脉内并不存在CD40L，仅仅只存在CD40，但是在存在着动脉粥样硬化内皮细胞中CD40L与CD40均存在。而进一步的研究证明，一旦位于血管平滑肌内的CD40L被激活，会使得细胞外间质胶原纤维的降解增大，从而使得动脉血管内斑块的不稳定性增加，进一步加速下肢动脉硬化闭塞症的发生[13]。
本病例对照研究中，下肢动脉硬化闭塞症组在rs1883832C/T位点上CC等位基因的频率要显著高于与健康对照组（P<0.05）。同时，我们发现rs1883832C基因携带者患下肢动脉硬化闭塞症的风险是T基因携带者的1.304倍（OR=1.304）。上述研究结果表明：CD40基因多态性位点rs1883832C/T与下肢动脉硬化闭塞症的发病显著相关，其中C等位基因可能是该疾病的危险因素。这一研究结果也与国内外相关的研究结果相印证。国内学者的研究发现，CD40的多态性可影响CD40基因及蛋白表达，进而对于CD40相关疾病的发展和转归都能发生相应的影响[12]，结合本次实验结果，我们认为CD40基因rs1883832C/T位点C基因在下肢动脉硬化闭塞症的发病中起到重要作用， C等位基因可能通过促进CD40基因多态性的表达而促进下肢动脉硬化闭塞症的发病。在现代的研究中相关的学者目前在动脉粥样硬化的基础研究中已经达成共识，即动脉粥样硬化为“炎症损伤反应”机制下的一个产物。而CD40可以通过对于MCP-1的表达进行上调，从而促进血管平滑肌的细胞分裂增殖，同时还能使原本处于静止状态的位于中层的平滑肌细胞进行迁移，往内膜处进行迁移，最终形成纤维性斑块。同时CD40不断的增加炎症因子的释放，导致了血管内皮的损伤，并且发生沉积反应，最后激活CD40基因，使得免疫细胞大量的聚集，发生一系列相关的反应后最终导致了动脉粥样硬化的形成[14，15]。
本研究结果提示CD40基因多态性与下肢动脉硬化闭塞症之间具有相关性，但基因与该疾病之间的具体分子生物学机制以及CD40基因在下肢动脉硬化闭塞症发病中所占的比重仍然未知，要真正搞清这些问题，在基因角度上提出疾病预防的依据，仍然需要大样本、多中心的随机对照研究的印证。 [参考文献]
[1] 章森苗. 经腘动脉入路逆行内膜下血管成形术治疗股浅动脉长段硬化性闭塞症的临床研究[J]. 中国普通外科杂志，2015，26（6）：818-822.
[2] 中华医学会外科学分会血管外科学组. 下肢动脉硬化闭塞症诊疗指南[J]. 中华医学杂志，2015，95（24）：1883-1896.
[3] Shamsara J，Mohammadpour AH，Behravan J，et al. Pentoxifylline decreases soluble CD40 ligand concentration and CD40 gene expression in coronary artery disease patients[J]. Immunopharmacology and Immunotoxicology，2012， 34（3）：523-529.
[4] Pamukcu B，Lip GY，Snezhitskiy V，et al. The CD40-CD40L system in cardiovascular disease[J]. Annals of Medicine，2011，43（5）：331-340.
[5] 程斌，鐘里科，王增，等. 从肺癌组织提取高纯度总RNA方法的优化及应用[J]. 中国现代应用药学，2016 ，33（5）：539-543.
[6] 崔映宇，范海燕，等. 一种分子量标准的引物定位合成[J].阜阳师范学院学报（自然科学版），2000，17（1）：8-11.
[7] Wang M，Li Y，Li W，et al. The CD40 gene polymorphism rs1883832 is associated with risk of acute coronary syndrome in a Chinese case-control study[J]. Dna