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摘要：目的： 探讨抗人转铁蛋白受体（TfR）单克隆抗体（mAb）体外抗瘤效应。方法： 采用CFSE染色、 PIAnnexin Ⅴ染色和PI染色， 通过流式细胞术分析抗人TfR mAb对高表达的人肝癌细胞系HepG2和人乳腺癌细胞系MCF7增殖、凋亡和周期的影响； 通过MTT法检测抗人TfR mAb联合化疗药物对HepG2和MCF7细胞增殖的抑制作用。结果： 抗人TfR mAb能抑制HepG2和MCF7细胞的增殖， 并诱导其凋亡和S期阻滞； 与化疗药物联用可增强其对肿瘤细胞增殖的抑制作用。结论： 抗人TfR mAb具有良好的体外抗瘤效应。
关键字：转铁蛋白受体单克隆抗体体外抗瘤效应
转铁蛋白受体（transferrin receptor， TfR）， 即CD71分子，是细胞获得铁元素的关键性分子。由于TfR是细胞增殖所必须的， 而且在快速生长的肿瘤细胞表面稳定性的高表达[1]， 因而成为肿瘤生物治疗的一个相对特异性的靶点。针对TfR的治疗性抗体发展迅速， 并在体内、 外的抗瘤研究中取得了良好的效果。但有研究显示， 不同的TfR抗体的生物学活性不尽相同[2]。我室所获得的抗人TfR单克隆抗体（mAb）可以特异性识别人肿瘤细胞表面TfR胞外端， 并具有较高的亲合力， 前期实验显示其对人红白血病细胞系K562具有明显的抗瘤作用[3]。在此我们进一步观察抗人TfR mAb对高表达TfR的人肝癌细胞系（HepG2）和人乳腺癌细胞系（MCF7）的增殖、 周期和凋亡的影响； 以及与临床常用化疗药物[5氟尿嘧啶（5FU）、 阿霉素（ADM）]是否存在协同抗瘤作用， 为临床应用研究提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料 抗人TfR mAb为本室所收藏的分泌抗人TfR杂交瘤细胞株， 经诱生BALB/c（nu/nu）裸鼠腹水， DEAESephadex A50纯化， SDSPAGE电泳鉴定。羧基荧光素二酯酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）、 碘化丙啶（PI）、 四甲基偶氮唑蓝（MTT）、 二甲亚砜（DMSO）均为Sigma公司产品。PIAnnexin Ⅴ细胞凋亡检测试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司产品。5FU为浙江海正药业有限公司产品。ADM为法玛西亚有限公司产品。人肝癌细胞系HepG2和人乳腺癌细胞系MCF7均由本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 CFSE染色检测肿瘤细胞增殖 分别收集对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞， 用冰冷的PBS液洗涤2次后， 调整细胞密度为5×109/L， 取1 mL加入1 μL CFSE（终浓度为1 μmol/L）置于37℃， 孵育30 min。加入1 mL小牛血清终止染色， 再用冰冷的PBS洗涤3次后接种于24孔培养板中（5×104/孔）。并预留1×106个染色后的细胞作为母代细胞， 40 g/L多聚甲醛固定后4℃避光保存， 待上机。待细胞贴壁后分别加入抗人TfR mAb至终浓度为20、 40、 60、 80和100 mg/L， 每种浓度重复3孔。并设相同浓度的非特异性鼠源性IgG作为对照。作用72 h后， 收集各组细胞。用冰冷的PBS液洗涤后， 采用流式细胞仪FACS检测， 并利用ModFit LT for Mac Ⅴ3.0软件进行参数获取和数据分析。
1.2.2 PIAnnexin Ⅴ染色检测肿瘤细胞凋亡 分别取对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞接种于24孔培养板中（5×104/孔）， 加入抗人TfR mAb至终浓度为60 mg/L， 重复3孔。并设相同浓度的非特异性鼠源性IgG作为对照。作用72 h后， 收集各组细胞。用冰冷的PBS液洗涤2次后， 按PIAnnexin Ⅴ细胞凋亡检测试剂盒说明书操作， 采用流式细胞仪FACS检测， 并利用CellQuest软件进行参数获取和数据分析。
1.2.3 PI染色检测肿瘤细胞周期 分别取对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞接种于24孔培养板（5×104/孔）， 加入抗人TfR mAb至终浓度为60 mg/L， 重复3孔。并设相同浓度的非特异性鼠源性IgG作为阴性对照。作用72 h后， 收集各组细胞。用冰冷的PBS液洗涤2次后， 加入预冷的700 mL/L乙醇固定细胞4℃过夜。流式检测前用PBS液洗去固定液， 加入0.5 mL的PI综合染液（含50 g/L RNA酶）， 避光染色30 min后， 采用流式细胞仪FACS检测， 并利用ModFit LT for Mac Ⅴ3.0软件进行参数获取和数据分析。
1.2.4 MTT比色法检测抗人TfR mAb联合化疗药物对肿瘤细胞增殖抑制作用 分别取对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞接种于96孔培养板（1×104/孔）， 待细胞贴壁后， 根据预实验结果分别加入IC50浓度的化疗药物（5FU、 ADM）和抗人TfR mAb， 37℃， 50 mL/L CO2继续培养48 h后， 每孔加入10 μL MTT（终浓度为0.5 g/L）， 继续培养4 h后， 1000 r/min离心10 min， 弃上清， 每孔加100 μL DMSO， 室温放置15 min， 待甲臜完全溶解后， 用酶标仪测定其A570值（以A630校准）。实验分为单用抗人TfR mAb组、 单用化疗药物组和抗人TfR mAb联用化疗药物组。生长抑制率按如下公式计算：生长抑制率=[（1-实验组平均A值）/对照组平均A值]×100%。
1.2.5 统计学分析 实验数据使用x±s表示， 采用SPSS13.0统计软件进行Independent Sample T Test或OneWay ANOVA分析， 组内差异采用LSD检验和q检验， 以P<0.01为具有统计学意义。
2 结果
2.1 抗人TfR mAb对肿瘤细胞增殖的抑制作用 CFSE预染的HepG2细胞和MCF7细胞在含20、 40、 60、 80和100 mg/L抗人TfR mAb的培养液中培养72 h后， 与对照组（含相同浓度的鼠源性IgG）相比， 增殖指数明显下降， 具有统计学意义（P<0.01， 图1）。 图1 抗人TfR mAb对HepG2细胞和MCF7细胞的生长抑制作用（略）
2.2 抗人TfR mAb诱导肿瘤细胞凋亡 如图2所示， HepG2细胞和MCF7细胞在含60 mg/L抗人TfR mAb的培养液中培养72 h后， PI和 Annexin ⅤFITC染色后， 以PI和 Annexin Ⅴ双阳性细胞作为凋亡细胞， 2种细胞均可见实验组细胞凋亡率明显高于对照组（含相同浓度非特异性鼠源性IgG）， 具有统计学意义（P<0.01， 图2）
图2 抗人TfR mAb诱导HepG2细胞和MCF7细胞凋亡（略）
2.3 抗人TfR mAb诱导肿瘤细胞S期阻滞 60 mg/L抗人TfR mAb作用于HepG2细胞和MCF7细胞72 h后， 与对照组（含相同浓度非特异性鼠源性IgG）相比， S期比例增加。HepG2细胞由（31.27±0.76）%增至（45.09±0.91）%； MCF7细胞由（24.58±1.64）%增至（40.45±1.16）%， P<0.01， 具有统计学意义。而G0/G1期比例降低， HepG2细胞由（58.41±1.87）%降至（43.53±2.06）%； MCF7细胞由（68.83±2.67）%降至（52.22±1.03）%， P<0.01， 具有统计学意义， G2/M期变化不明显， 即出现了明显的S期阻滞（图3）。
图3 抗人TfR mAb引起HepG2细胞和MCF7细胞S期阻滞（略）
A： HepG2+对照； B： HepG2+抗TfR mAb； C： MCF7+对照； D： MCF7+抗TfR mAb.
2.4 抗人TfR mAb联合化疗药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用 当抗人TfR mAb与化疗药物5FU和ADM联合作用于HepG2细胞和MCF7细胞48 h后， 联合作用组的生长抑制率明显高于单独作用组， 具有统计学意义（P<0.01， 图4）。
图4 抗人TfR mAb增强化疗药物对HepG2和MCF7细胞增殖的抑制作用（略）
3 讨论
TfR是一种与细胞内铁摄取和调节细胞生长相关的跨膜糖蛋白， 由它与其配体Tf介导的铁元素的胞内转运是细胞获得铁元素的重要途径[1]。有研究表明， 由于TfR在铁摄取中的重要作用， 减弱其功能会促进细胞的死亡[2]。本研究中所用抗人TfR mAb能够特异性与TfR胞外端结合， 干扰细胞的铁摄取，明显抑制高表达TfR的HepG2细胞和MCF7细胞的增殖， 并能够诱导其凋亡， 而且这2种效应在20 mg/L至100 mg/L的浓度范围内呈浓度依赖性（数据未显示）， 与我们前期对K562细胞的研究结果一致[3]。
抗人TfR mAb作用于HepG2细胞和MCF7细胞后， S期细胞的比例明显增加， 相应G0/G1期细胞的比例明显减少， 而G2/M期细胞的比例变化不明显， 出现典型的S期阻滞。有研究显示， 当细胞DNA被烷基化、 断裂或复制受阻时， 细胞周期出现停滞， 不能及时进入下一个时相， 即出现细胞周期阻滞[4]。而S期阻滞往往被视为是细胞在DNA损伤后， 细胞对DNA损伤修复的一种反应， 这就提示抗人TfR mAb可能通过某种途径影响肿瘤细胞DNA的合成或者是细胞周期调控点（如G2/M转折点）的调控， 其具体机制有待进一步的研究。
抗人TfR mAb能够使肿瘤细胞中处于G0/G1期的细胞比例减少， 增加了S期细胞的比例， 而S期细胞比G0/G1或G2/M期细胞更易于凋亡， 对化疗药物也更敏感[5]。所以将抗人TfR mAb与化疗药物联合应用时， 无论是细胞周期特异性化疗药物（如5FU）还是细胞周期非特异性化疗药物（如ADM）， 都能够明显地增强其对肿瘤细胞的抑制作用。在临床上一般认为， 肿瘤化疗中G0/G1期细胞的大量存在是肿瘤复发和转移的主要原因之一[6]。利用抗人TfR mAb能够诱导肿瘤细胞S期阻滞， 减少G0/G1期细胞这一特点， 将其与化疗药物联合将具有良好的应用前景。
【参考文献】
[1] Leplletier Y， CamaraClayette V， Jin H， et al. Prevention of mantle lymphoma tumor establishment by routing transferrin receptor toward lysosomal compartments[J]. Cancer Res， 2007， 67（3）： 1145-1154.
[2] Daniel TR， Delgado T， Rodriguez JA， et al. The transferrin receptor partⅠ： biology and targeting with cytotoxic antibodies for the treatment of cancer[J]. Clin Immunol， 2006， 121（2）： 144-158.
[3] Qing Y， Shuo W， Zhihua W， et al. The in vitro antitumor effect and in vivo tumorspecificity distribution of humanmouse chimeric antibody against transferrin receptor[J]. Cancer Immunol Immunother， 2006， 55（9）： 1111-1121.
[4] Paulovich AG， Hartwell LH. A checkpoint regulates the rate of progression through S phase to DNA damage[J]. Cell， 1995， 82（5）： 841-847.
[5] Huang X， Halicka HD， Traganos F， et al. Cytometic assessment of DNA damage in relation to cell cycle phase and apoptosis[J]. Cell Prolif， 2005， 38（4）： 223-243.
[6] 王世宏， 魏 伟， 许杜鹃， 等. 白芍总苷对HepG2细胞增殖的抑制作用[J]. 安徽医科大学学报， 2006， 41（5）： 547-549
关键字：转铁蛋白受体单克隆抗体体外抗瘤效应
转铁蛋白受体（transferrin receptor， TfR）， 即CD71分子，是细胞获得铁元素的关键性分子。由于TfR是细胞增殖所必须的， 而且在快速生长的肿瘤细胞表面稳定性的高表达[1]， 因而成为肿瘤生物治疗的一个相对特异性的靶点。针对TfR的治疗性抗体发展迅速， 并在体内、 外的抗瘤研究中取得了良好的效果。但有研究显示， 不同的TfR抗体的生物学活性不尽相同[2]。我室所获得的抗人TfR单克隆抗体（mAb）可以特异性识别人肿瘤细胞表面TfR胞外端， 并具有较高的亲合力， 前期实验显示其对人红白血病细胞系K562具有明显的抗瘤作用[3]。在此我们进一步观察抗人TfR mAb对高表达TfR的人肝癌细胞系（HepG2）和人乳腺癌细胞系（MCF7）的增殖、 周期和凋亡的影响； 以及与临床常用化疗药物[5氟尿嘧啶（5FU）、 阿霉素（ADM）]是否存在协同抗瘤作用， 为临床应用研究提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料 抗人TfR mAb为本室所收藏的分泌抗人TfR杂交瘤细胞株， 经诱生BALB/c（nu/nu）裸鼠腹水， DEAESephadex A50纯化， SDSPAGE电泳鉴定。羧基荧光素二酯酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）、 碘化丙啶（PI）、 四甲基偶氮唑蓝（MTT）、 二甲亚砜（DMSO）均为Sigma公司产品。PIAnnexin Ⅴ细胞凋亡检测试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司产品。5FU为浙江海正药业有限公司产品。ADM为法玛西亚有限公司产品。人肝癌细胞系HepG2和人乳腺癌细胞系MCF7均由本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 CFSE染色检测肿瘤细胞增殖 分别收集对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞， 用冰冷的PBS液洗涤2次后， 调整细胞密度为5×109/L， 取1 mL加入1 μL CFSE（终浓度为1 μmol/L）置于37℃， 孵育30 min。加入1 mL小牛血清终止染色， 再用冰冷的PBS洗涤3次后接种于24孔培养板中（5×104/孔）。并预留1×106个染色后的细胞作为母代细胞， 40 g/L多聚甲醛固定后4℃避光保存， 待上机。待细胞贴壁后分别加入抗人TfR mAb至终浓度为20、 40、 60、 80和100 mg/L， 每种浓度重复3孔。并设相同浓度的非特异性鼠源性IgG作为对照。作用72 h后， 收集各组细胞。用冰冷的PBS液洗涤后， 采用流式细胞仪FACS检测， 并利用ModFit LT for Mac Ⅴ3.0软件进行参数获取和数据分析。
1.2.2 PIAnnexin Ⅴ染色检测肿瘤细胞凋亡 分别取对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞接种于24孔培养板中（5×104/孔）， 加入抗人TfR mAb至终浓度为60 mg/L， 重复3孔。并设相同浓度的非特异性鼠源性IgG作为对照。作用72 h后， 收集各组细胞。用冰冷的PBS液洗涤2次后， 按PIAnnexin Ⅴ细胞凋亡检测试剂盒说明书操作， 采用流式细胞仪FACS检测， 并利用CellQuest软件进行参数获取和数据分析。
1.2.3 PI染色检测肿瘤细胞周期 分别取对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞接种于24孔培养板（5×104/孔）， 加入抗人TfR mAb至终浓度为60 mg/L， 重复3孔。并设相同浓度的非特异性鼠源性IgG作为阴性对照。作用72 h后， 收集各组细胞。用冰冷的PBS液洗涤2次后， 加入预冷的700 mL/L乙醇固定细胞4℃过夜。流式检测前用PBS液洗去固定液， 加入0.5 mL的PI综合染液（含50 g/L RNA酶）， 避光染色30 min后， 采用流式细胞仪FACS检测， 并利用ModFit LT for Mac Ⅴ3.0软件进行参数获取和数据分析。
1.2.4 MTT比色法检测抗人TfR mAb联合化疗药物对肿瘤细胞增殖抑制作用 分别取对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞接种于96孔培养板（1×104/孔）， 待细胞贴壁后， 根据预实验结果分别加入IC50浓度的化疗药物（5FU、 ADM）和抗人TfR mAb， 37℃， 50 mL/L CO2继续培养48 h后， 每孔加入10 μL MTT（终浓度为0.5 g/L）， 继续培养4 h后， 1000 r/min离心10 min， 弃上清， 每孔加100 μL DMSO， 室温放置15 min， 待甲臜完全溶解后， 用酶标仪测定其A570值（以A630校准）。实验分为单用抗人TfR mAb组、 单用化疗药物组和抗人TfR mAb联用化疗药物组。生长抑制率按如下公式计算：生长抑制率=[（1-实验组平均A值）/对照组平均A值]×100%。
1.2.5 统计学分析 实验数据使用x±s表示， 采用SPSS13.0统计软件进行Independent Sample T Test或OneWay ANOVA分析， 组内差异采用LSD检验和q检验， 以P<0.01为具有统计学意义。
2 结果
2.1 抗人TfR mAb对肿瘤细胞增殖的抑制作用 CFSE预染的HepG2细胞和MCF7细胞在含20、 40、 60、 80和100 mg/L抗人TfR mAb的培养液中培养72 h后， 与对照组（含相同浓度的鼠源性IgG）相比， 增殖指数明显下降， 具有统计学意义（P<0.01， 图1）。 图1 抗人TfR mAb对HepG2细胞和MCF7细胞的生长抑制作用（略）
2.2 抗人TfR mAb诱导肿瘤细胞凋亡 如图2所示， HepG2细胞和MCF7细胞在含60 mg/L抗人TfR mAb的培养液中培养72 h后， PI和 Annexin ⅤFITC染色后， 以PI和 Annexin Ⅴ双阳性细胞作为凋亡细胞， 2种细胞均可见实验组细胞凋亡率明显高于对照组（含相同浓度非特异性鼠源性IgG）， 具有统计学意义（P<0.01， 图2）
图2 抗人TfR mAb诱导HepG2细胞和MCF7细胞凋亡（略）
2.3 抗人TfR mAb诱导肿瘤细胞S期阻滞 60 mg/L抗人TfR mAb作用于HepG2细胞和MCF7细胞72 h后， 与对照组（含相同浓度非特异性鼠源性IgG）相比， S期比例增加。HepG2细胞由（31.27±0.76）%增至（45.09±0.91）%； MCF7细胞由（24.58±1.64）%增至（40.45±1.16）%， P<0.01， 具有统计学意义。而G0/G1期比例降低， HepG2细胞由（58.41±1.87）%降至（43.53±2.06）%； MCF7细胞由（68.83±2.67）%降至（52.22±1.03）%， P<0.01， 具有统计学意义， G2/M期变化不明显， 即出现了明显的S期阻滞（图3）。
图3 抗人TfR mAb引起HepG2细胞和MCF7细胞S期阻滞（略）
A： HepG2+对照； B： HepG2+抗TfR mAb； C： MCF7+对照； D： MCF7+抗TfR mAb.
2.4 抗人TfR mAb联合化疗药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用 当抗人TfR mAb与化疗药物5FU和ADM联合作用于HepG2细胞和MCF7细胞48 h后， 联合作用组的生长抑制率明显高于单独作用组， 具有统计学意义（P<0.01， 图4）。
图4 抗人TfR mAb增强化疗药物对HepG2和MCF7细胞增殖的抑制作用（略）
3 讨论
TfR是一种与细胞内铁摄取和调节细胞生长相关的跨膜糖蛋白， 由它与其配体Tf介导的铁元素的胞内转运是细胞获得铁元素的重要途径[1]。有研究表明， 由于TfR在铁摄取中的重要作用， 减弱其功能会促进细胞的死亡[2]。本研究中所用抗人TfR mAb能够特异性与TfR胞外端结合， 干扰细胞的铁摄取，明显抑制高表达TfR的HepG2细胞和MCF7细胞的增殖， 并能够诱导其凋亡， 而且这2种效应在20 mg/L至100 mg/L的浓度范围内呈浓度依赖性（数据未显示）， 与我们前期对K562细胞的研究结果一致[3]。
抗人TfR mAb作用于HepG2细胞和MCF7细胞后， S期细胞的比例明显增加， 相应G0/G1期细胞的比例明显减少， 而G2/M期细胞的比例变化不明显， 出现典型的S期阻滞。有研究显示， 当细胞DNA被烷基化、 断裂或复制受阻时， 细胞周期出现停滞， 不能及时进入下一个时相， 即出现细胞周期阻滞[4]。而S期阻滞往往被视为是细胞在DNA损伤后， 细胞对DNA损伤修复的一种反应， 这就提示抗人TfR mAb可能通过某种途径影响肿瘤细胞DNA的合成或者是细胞周期调控点（如G2/M转折点）的调控， 其具体机制有待进一步的研究。
抗人TfR mAb能够使肿瘤细胞中处于G0/G1期的细胞比例减少， 增加了S期细胞的比例， 而S期细胞比G0/G1或G2/M期细胞更易于凋亡， 对化疗药物也更敏感[5]。所以将抗人TfR mAb与化疗药物联合应用时， 无论是细胞周期特异性化疗药物（如5FU）还是细胞周期非特异性化疗药物（如ADM）， 都能够明显地增强其对肿瘤细胞的抑制作用。在临床上一般认为， 肿瘤化疗中G0/G1期细胞的大量存在是肿瘤复发和转移的主要原因之一[6]。利用抗人TfR mAb能够诱导肿瘤细胞S期阻滞， 减少G0/G1期细胞这一特点， 将其与化疗药物联合将具有良好的应用前景。
【参考文献】
[1] Leplletier Y， CamaraClayette V， Jin H， et al. Prevention of mantle lymphoma tumor establishment by routing transferrin receptor toward lysosomal compartments[J]. Cancer Res， 2007， 67（3）： 1145-1154.
[2] Daniel TR， Delgado T， Rodriguez JA， et al. The transferrin receptor partⅠ： biology and targeting with cytotoxic antibodies for the treatment of cancer[J]. Clin Immunol， 2006， 121（2）： 144-158.
[3] Qing Y， Shuo W， Zhihua W， et al. The in vitro antitumor effect and in vivo tumorspecificity distribution of humanmouse chimeric antibody against transferrin receptor[J]. Cancer Immunol Immunother， 2006， 55（9）： 1111-1121.
[4] Paulovich AG， Hartwell LH. A checkpoint regulates the rate of progression through S phase to DNA damage[J]. Cell， 1995， 82（5）： 841-847.
[5] Huang X， Halicka HD， Traganos F， et al. Cytometic assessment of DNA damage in relation to cell cycle phase and apoptosis[J]. Cell Prolif， 2005， 38（4）： 223-243.
[6] 王世宏， 魏 伟， 许杜鹃， 等. 白芍总苷对HepG2细胞增殖的抑制作用[J]. 安徽医科大学学报， 2006， 41（5）： 547-549