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摘要：刺五加含有多种活性物质，具有良好的药用价值。本研究采用水浸泡法获得刺五加提取物。体外抗氧化实验证明，该提取物具有良好的清除自由基能力、还原金属铜离子能力和抑制脂质过氧化能力。在HepG2细胞氧化损伤模型中，刺五加提取物有效保护了H2O2诱导的细胞氧化损伤。
关键词：刺五加；抗氧化活性；HepG2细胞；氧化损伤
1. 引言
刺五加是一种主要产于我国东北地区和河北、山西部分地区的五加科五加属灌木植物，其干燥的根、茎可入药，其味辛、微苦、性温，归脾、肾、心经，具有益气健脾、补肾安神的功效。刺五加中含有的活性成分较多，主要有酚苷类化合物、黄酮类化合物、刺五加多糖以及多种微量元素和氨基酸等。有研究表明，刺五加具有多种药理活性，具有抗炎、抗病毒、及抗肿瘤功效，能有效保护心血管系统，此外还能有效增强人体抵抗力等。亦有研究表明，刺五加提取物具有良好的抗氧化活性。陈人豪等人采用醇提法，从刺五加根茎中提取活性物质，利用大鼠脑缺血再灌注动物模型研究了刺五加提取物对大鼠缺血脑组织的保护作用。结果显示，刺五加提取物能有效减少脑组织缺血再灌注引起的损伤和凋亡，该保护作用可能与刺五加的抗氧化活性相关。田松阳等人采用水提法获得刺五加水提物，在体外该水提物表现出良好的清除DPPH自由基能力，表明该水提物具有一定的抗氧化能力。在小鼠酒精性肝损伤模型中，刺五加皂苷改善了酒精引起的肝损伤程度，通过抗氧化作用并降低多种炎性因子，进而发挥肝保护作用。多项研究表明，刺五加提取物具有一定的抗氧化能力。本文采用水提取法获得刺五加水提物，采用过氧化氢诱导的人肝癌细胞HepG2氧化损伤模型，探究刺五加水提物的抗氧化损伤能力。
2. 材料与方法
2.1 实验细胞
人肝癌细胞系HepG2
2.2 实验试剂
刺五加，DPPH，乙醇，过氧化氢，MTT，新亚铜，β-胡萝卜素，亚油酸。
2.3 实验方法
2.3.1 刺五加水提物制备
参考田松阳等人刺五加水提物制备方法并优化。简述如下：取10g刺五加并捣碎，加入蒸馏水800ml，浸泡过夜。离心除去固体物质，将上清液置于旋转蒸发器中浓缩，最后取浓缩液冻干。临用前称取冻干物制配置成10mg/ml水溶液。
2.3.2 刺五加水提物体外抗氧化检测
采用DPPH自由基清除法、铜离子还原能力测定法（CUPRAC法）以及抑制脂质氧化法分别测定刺五加水提物的体外抗氧化能力。
无水乙醇配制浓度为40mg/L的DPPH溶液，避光保存。刺五加水提物配置成浓度为1mg/ml水溶液。取两支试管，0号试管作为对照分别加入DPPH溶液2ml，无水乙醇溶液1ml；1号试管作为实验组，分别加入DPPH溶液2ml，无水乙醇950μL和刺五加提取物水溶液50μL。混匀后室温静置30min，测定各管溶液在517nm处的吸光度，用无水乙醇调零。计算刺五加水提物对DPPH自由基的清除率。
取两只试管。0号试管作为调零对照组分别加入100μL的无水乙醇溶液、5mM CuSO4溶液1mL、3.75mM 新亚铜试剂1mL、乙酸铵溶液1mL和纯水1mL。1号试管分别加入刺五加水提物溶液100μL、5mM CuSO4溶液1mL、3.75mM的新亚铜试剂1mL、乙酸铵溶液1mL和纯水1mL。将试管混匀后室温静置30min充分反应，测定各管在450nm处的吸光度。
按照文献分别制备亚油酸溶液和反应介质溶液。取6只试管分两组，每组3只编号为0、1、2号试管。0号试管加4ml亚油酸溶液作为调零组，1号试管加4ml反应介质溶液和100μL无水乙醇作为对照，2号试管加4ml反应介质溶液和100μL1mg/ml刺五加水提物溶液为实验组。配置完毕后混匀，马上测定第一组对照和实验组试管在470nm处的吸光度值。第二组试管在50℃水浴孵育150min后测定对照和实验组试管吸光度值。根据下列公式计算刺五加水提物的脂质氧化抑制率。
2.3.3 刺五加水提物保护HepG2细胞氧化损伤
采用过氧化氢制备HepG2细胞氧化损伤模型。将生长旺盛的HepG2细胞消化并计数，以5000个细胞/孔接种于96孔板中，培养过夜。用培养液配制浓度分别为0，25，50，100，200μM的H2O2溶液，并替换原培养液。继续培养24h后，每孔换无血清培养液100μL，加入MTT溶液10μL，37℃孵育3h。孵育结束后吸弃孔中培养液，每孔加150μL DMSO充分溶解蓝紫色沉淀，测定各孔490nm处的吸光度值。检测刺五加水提物对HepG2细胞氧化损伤时，按上述方法接种96孔板，用含1mg/ml刺五加水提物的培养液预处理细胞3h后，替换为含0，25，50，100，200μM H2O2的培养液，培养24h后进行MTT检测，方法如上。
3 实验结果
3.1 刺五加水提物体外抗氧化能力测定
DPPH自由基清除实验表明刺五加水提物具有良好的自由基清除能力。对照组试管在517nm处的吸光度值为0.675，实验组试管在517nm处的吸光度值为0.275，根据公式计算得出，刺五加水提物1mg/ml溶液自由基清除率可达59.3%。CUPRAC法结果显示刺五加水提物具有良好的还原金属铜离子能力，其实验组吸光度值达0.683。抑制脂质过氧化实验结果显示，在t=0时，对照组和实验组的吸光度值分别为0.075和0.077；在t=150min时，对照组和实验组的吸光度值分别为0.067和0.078，根据公式计算其脂质过氧化抑制率为81.8%。另外，我们还发现，提取过程中的温度及溶液pH值能显著影响刺五加水提物的抗氧化活性。随着温度升高，刺五加水提物的抗氧化能力逐渐下降，当温度高于50℃时，其抗氧化活性有显著的下降；当溶液pH在5-6之间时，刺五加水提物抗氧化能力最强。
3.2 刺五加水提物保护HepG2细胞氧化损伤
MTT结果显示，与对照相比H2O2显著抑制了HepG2细胞活力，呈现剂量依赖性关系。最高浓度H2O2作用24h后，细胞活力仅为对照组的34%。而刺五加水提物预处理后有效提高了HepG2细胞活力。在无H2O2作用下，刺五加水提物略提高细胞活力，但不明显。在25、50和100μMH2O2作用下，刺五加水提物预处理组与对照相比细胞活力显著增加，表明刺五加水提物能有效保护HepG2细胞受到H2O2引起的氧化损伤，结果见图1。但高浓度H2O2处理组中，刺五加水提物保护效果不明显。
4. 结论
我们的研究结果显示，刺五加水提物在体外有良好的抗氧化能力。能有效清除DPPH自由基、还原金属铜离子以及抑制脂质过氧化。在HepG2氧化损伤模型中，刺五加水提物预处理能有效保護细胞减轻H2O2引起的氧化损伤。
作者简介：
张仁文（1986- ），男，山西朔州人，主要从事细胞和分子生物学相关研究。
关键词：刺五加；抗氧化活性；HepG2细胞；氧化损伤
1. 引言
刺五加是一种主要产于我国东北地区和河北、山西部分地区的五加科五加属灌木植物，其干燥的根、茎可入药，其味辛、微苦、性温，归脾、肾、心经，具有益气健脾、补肾安神的功效。刺五加中含有的活性成分较多，主要有酚苷类化合物、黄酮类化合物、刺五加多糖以及多种微量元素和氨基酸等。有研究表明，刺五加具有多种药理活性，具有抗炎、抗病毒、及抗肿瘤功效，能有效保护心血管系统，此外还能有效增强人体抵抗力等。亦有研究表明，刺五加提取物具有良好的抗氧化活性。陈人豪等人采用醇提法，从刺五加根茎中提取活性物质，利用大鼠脑缺血再灌注动物模型研究了刺五加提取物对大鼠缺血脑组织的保护作用。结果显示，刺五加提取物能有效减少脑组织缺血再灌注引起的损伤和凋亡，该保护作用可能与刺五加的抗氧化活性相关。田松阳等人采用水提法获得刺五加水提物，在体外该水提物表现出良好的清除DPPH自由基能力，表明该水提物具有一定的抗氧化能力。在小鼠酒精性肝损伤模型中，刺五加皂苷改善了酒精引起的肝损伤程度，通过抗氧化作用并降低多种炎性因子，进而发挥肝保护作用。多项研究表明，刺五加提取物具有一定的抗氧化能力。本文采用水提取法获得刺五加水提物，采用过氧化氢诱导的人肝癌细胞HepG2氧化损伤模型，探究刺五加水提物的抗氧化损伤能力。
2. 材料与方法
2.1 实验细胞
人肝癌细胞系HepG2
2.2 实验试剂
刺五加，DPPH，乙醇，过氧化氢，MTT，新亚铜，β-胡萝卜素，亚油酸。
2.3 实验方法
2.3.1 刺五加水提物制备
参考田松阳等人刺五加水提物制备方法并优化。简述如下：取10g刺五加并捣碎，加入蒸馏水800ml，浸泡过夜。离心除去固体物质，将上清液置于旋转蒸发器中浓缩，最后取浓缩液冻干。临用前称取冻干物制配置成10mg/ml水溶液。
2.3.2 刺五加水提物体外抗氧化检测
采用DPPH自由基清除法、铜离子还原能力测定法（CUPRAC法）以及抑制脂质氧化法分别测定刺五加水提物的体外抗氧化能力。
无水乙醇配制浓度为40mg/L的DPPH溶液，避光保存。刺五加水提物配置成浓度为1mg/ml水溶液。取两支试管，0号试管作为对照分别加入DPPH溶液2ml，无水乙醇溶液1ml；1号试管作为实验组，分别加入DPPH溶液2ml，无水乙醇950μL和刺五加提取物水溶液50μL。混匀后室温静置30min，测定各管溶液在517nm处的吸光度，用无水乙醇调零。计算刺五加水提物对DPPH自由基的清除率。
取两只试管。0号试管作为调零对照组分别加入100μL的无水乙醇溶液、5mM CuSO4溶液1mL、3.75mM 新亚铜试剂1mL、乙酸铵溶液1mL和纯水1mL。1号试管分别加入刺五加水提物溶液100μL、5mM CuSO4溶液1mL、3.75mM的新亚铜试剂1mL、乙酸铵溶液1mL和纯水1mL。将试管混匀后室温静置30min充分反应，测定各管在450nm处的吸光度。
按照文献分别制备亚油酸溶液和反应介质溶液。取6只试管分两组，每组3只编号为0、1、2号试管。0号试管加4ml亚油酸溶液作为调零组，1号试管加4ml反应介质溶液和100μL无水乙醇作为对照，2号试管加4ml反应介质溶液和100μL1mg/ml刺五加水提物溶液为实验组。配置完毕后混匀，马上测定第一组对照和实验组试管在470nm处的吸光度值。第二组试管在50℃水浴孵育150min后测定对照和实验组试管吸光度值。根据下列公式计算刺五加水提物的脂质氧化抑制率。
2.3.3 刺五加水提物保护HepG2细胞氧化损伤
采用过氧化氢制备HepG2细胞氧化损伤模型。将生长旺盛的HepG2细胞消化并计数，以5000个细胞/孔接种于96孔板中，培养过夜。用培养液配制浓度分别为0，25，50，100，200μM的H2O2溶液，并替换原培养液。继续培养24h后，每孔换无血清培养液100μL，加入MTT溶液10μL，37℃孵育3h。孵育结束后吸弃孔中培养液，每孔加150μL DMSO充分溶解蓝紫色沉淀，测定各孔490nm处的吸光度值。检测刺五加水提物对HepG2细胞氧化损伤时，按上述方法接种96孔板，用含1mg/ml刺五加水提物的培养液预处理细胞3h后，替换为含0，25，50，100，200μM H2O2的培养液，培养24h后进行MTT检测，方法如上。
3 实验结果
3.1 刺五加水提物体外抗氧化能力测定
DPPH自由基清除实验表明刺五加水提物具有良好的自由基清除能力。对照组试管在517nm处的吸光度值为0.675，实验组试管在517nm处的吸光度值为0.275，根据公式计算得出，刺五加水提物1mg/ml溶液自由基清除率可达59.3%。CUPRAC法结果显示刺五加水提物具有良好的还原金属铜离子能力，其实验组吸光度值达0.683。抑制脂质过氧化实验结果显示，在t=0时，对照组和实验组的吸光度值分别为0.075和0.077；在t=150min时，对照组和实验组的吸光度值分别为0.067和0.078，根据公式计算其脂质过氧化抑制率为81.8%。另外，我们还发现，提取过程中的温度及溶液pH值能显著影响刺五加水提物的抗氧化活性。随着温度升高，刺五加水提物的抗氧化能力逐渐下降，当温度高于50℃时，其抗氧化活性有显著的下降；当溶液pH在5-6之间时，刺五加水提物抗氧化能力最强。
3.2 刺五加水提物保护HepG2细胞氧化损伤
MTT结果显示，与对照相比H2O2显著抑制了HepG2细胞活力，呈现剂量依赖性关系。最高浓度H2O2作用24h后，细胞活力仅为对照组的34%。而刺五加水提物预处理后有效提高了HepG2细胞活力。在无H2O2作用下，刺五加水提物略提高细胞活力，但不明显。在25、50和100μMH2O2作用下，刺五加水提物预处理组与对照相比细胞活力显著增加，表明刺五加水提物能有效保护HepG2细胞受到H2O2引起的氧化损伤，结果见图1。但高浓度H2O2处理组中，刺五加水提物保护效果不明显。
4. 结论
我们的研究结果显示，刺五加水提物在体外有良好的抗氧化能力。能有效清除DPPH自由基、还原金属铜离子以及抑制脂质过氧化。在HepG2氧化损伤模型中，刺五加水提物预处理能有效保護细胞减轻H2O2引起的氧化损伤。
作者简介：
张仁文（1986- ），男，山西朔州人，主要从事细胞和分子生物学相关研究。