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摘要：目的：建立咽舒乐颗粒中绿原酸含量的测定。方法：采用高效液相色谱法，色谱柱为Agilent 5TC-C18（2）（250mm×4.6mm，5μm），以乙腈-0.4%磷酸（10：90）为流动相;流速1.0ml/min;检测波长为327nm;柱温为25℃。结果：绿原酸线性范围为2.076～41.52ug/ml，呈现良好的线性关系，R = 0.99998，平均加样回收率为102.36 %（n= 6），RSD= 0.65 %。结论：該法稳定、快速、简便、准确，有可重复性，可用于咽舒乐颗粒中绿原酸的含量测定。
关键词：咽舒乐颗粒;高效液相色谱法;绿原酸
Abstract：Objective：To establish a method for determining the content of chlorogenic acid in Yan shule granules .Methods：High performance liquid chromatography（HPLC）was adopted by using Agilent 5TC-C18（2）column（250mm×4.6mm，5μm）.The mobile phase was methanol-water（10：90） The flow rate was 1.0mL/min，the detection wavelength was 327nm and the column temperature was 25℃.Results：Linear range of chlorogenic acid was between 2.076～41.52ug/ml and showed good linear relationship，which R = 0.99998. The average recovery rate was 102.36%（n=6），RSD=0.65%.Conclusion：This method，rapid，convenient，acctrate，reproducible，and could be used for determination of chlorogenic acid in Yan shule granules.
Keywords：Yan shule granules; HPLC;chlorogenic acid
咽舒乐颗粒主要由金荞麦、桔梗、沙参、石斛、忍冬藤等中药组合而成。是萍乡市中医院邱美和主任的经验方，并多年应用于临床的批文制剂。本方是以中医理论全面分析急慢性咽喉炎的病因，病机后，并结合了现代医学认识及中药药理研究成果而组成的一复方制剂。主要用于补肾，健脾，润肺，养血，活血生津，解毒，除烦，利咽，用于急慢性咽喉炎。其中忍冬藤有清热解毒消肿的功效[1]。有文献报道采用高效液相色谱法对咽舒乐颗粒中忍冬藤的有效成分绿原酸进行含量测定[2]。目前，咽舒乐颗粒的现行质量标准为《江西省食品药品监督管理局医疗机构制剂》GZJ-0293-（1）-2006，检验内容包括“性状、鉴别、检查”等，目前还没有含量测定的项目。为了使其更好的应用于临床，对其质量把控，提高质量标准，本实验选取咽舒乐颗粒中忍冬藤的主成分绿原酸为定量的指标，采用HPLC法测定绿原酸含量的方法研究。
1. 仪器、药品与试剂：
Agilent 1200型高效液相色谱仪：配1200四元低压梯度泵系列，Agilent1200化学工作站，DAD二极管阵列检测器。
绿原酸对照品来源（中国药品生物制品检定所提供，80℃减压干燥至恒重），批号：110753-201415 含量以96.2%计。水为超纯水，乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯。
2. 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Agilent 5TC-C18（250mm×4.6mm，5μm），流动相：以乙腈-0.4%磷酸（10：90），临用前以0.45?m微孔滤膜过滤并经超声脱气处理;检测的波长327nm;流速为1.0ml/min;柱温为25℃;进样量为10μl。理论板数按绿原酸峰计算应不低于1000。
2.2 溶液制备
2.2.1 对照品溶液的制备
取绿原酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含20?g的溶液，即得。
2.2.2 供试品溶液的制备
避光操作，取装量差异项下的内容物，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45?m微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
2.3 方法学考察
2.3.1 系统适用性实验
取对照品溶液、供试品溶液及空白溶剂，按2.1项下色谱条件测定，比较供试品溶液色谱、对照品色谱及空白溶剂色谱，结果供试品中绿原酸色谱峰有较好的色谱分离。
2.3.2 线性关系的考察
精密称取绿原酸对照品10.79mg，置100ml棕色量瓶中，加50%甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为绿原酸对照品母液，（10℃以下保存）;取母液再逐级稀释成2.076?g/ml、10.38?g/ml、20.76?g/ml、31.14?g/ml、41.52?g/ml的溶液，精密吸取上述对照品溶液及绿原酸对照品母液10μL注入液相色谱仪，以峰面积响应值Y为纵坐标，对照品浓度x为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程为Y= 30.328x -0.0053，R = 0.99998，说明绿原酸在2.076～41.52μg/ml之间有较好的线性关系。
2.3.3 精密度试验 精密吸取绿原酸对照品溶液（20.76μg/ml），按2.1项下色谱条件，重复进样6次，测定绿原酸峰面积RSD值为0.24%。表明精密度良好。
2.3.4 重复性试验
取同批样品（批号20160106），照2.3项下平行制备供试品溶液6份，照2.1项下色谱条件测定。结果绿原酸RSD为0.51%，表明此方法的重复性良好。
2.3.5加样回收率试验
精密称取已知含量的本品（批号20160106）6份，各约0.5g，置具塞锥形瓶中，分别精密添加对照品溶液（绿原酸对照品：10.38?g/ml）25ml，按2.1项下方法试验并算出回收率，结果见表1。
2.3.6 稳定性
精密吸取供试品溶液（批号20160106），分别在0、2、4、6、8、12h进样，按2.1项下色谱条件测定绿原酸的峰面积积分值，结果，绿原酸在12小时内峰面积无明显变化，RSD为0.16%（n=6），表明供试品溶液在12h内稳定。
2.3.7样品含量测定
取本品3批，照2.1项下方法试验，测定结果见表2。
根據结果，拟定本品每袋含忍冬藤以绿原酸（C16H18O9）计，不得少于0.82mg。
3. 讨论
本文参照《中国药典》2015年版一部[3]忍冬藤项下含量测定方法，选择327nm作为检测波长，选择乙腈-0.4%磷酸（10：90）为流动相，在此流动相条件下，组分的峰型及分离度均理想，同时未见其他成分干扰。因绿原酸见光易分解，考察了避光条件下与未避光条件下操作，结果避光条件下测得含量更大。
本文考察了甲醇、50%甲醇、稀乙醇，结果50%甲醇提取效率更高。参照《中国药典》2015年版一部忍冬藤项下含量测定方法，采用超声提取法，考察了超声提取20分钟、30分钟、40分钟，结果30分钟已提取完全。考察了20℃、25℃、30℃及35℃，结果25℃时峰面积最大。
本方法准确、快速，操作简便，专属性强，重现性好，可用于咽舒乐颗粒中绿原酸的含量测定。
参考文献：
[1] 余德洋.云南习用忍冬藤药材的化学成分研究[D].云南中医学院，
[2] 姜华，郭敏，徐世红，等.HPLC 法测定忍冬藤痛风颗粒中绿原酸的含量[J].西部中医药.2017，30（4）：25-27.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2015年版 一部）[M].北京：中国医药科技出版社.2015：129-130.
关键词：咽舒乐颗粒;高效液相色谱法;绿原酸
Abstract：Objective：To establish a method for determining the content of chlorogenic acid in Yan shule granules .Methods：High performance liquid chromatography（HPLC）was adopted by using Agilent 5TC-C18（2）column（250mm×4.6mm，5μm）.The mobile phase was methanol-water（10：90） The flow rate was 1.0mL/min，the detection wavelength was 327nm and the column temperature was 25℃.Results：Linear range of chlorogenic acid was between 2.076～41.52ug/ml and showed good linear relationship，which R = 0.99998. The average recovery rate was 102.36%（n=6），RSD=0.65%.Conclusion：This method，rapid，convenient，acctrate，reproducible，and could be used for determination of chlorogenic acid in Yan shule granules.
Keywords：Yan shule granules; HPLC;chlorogenic acid
咽舒乐颗粒主要由金荞麦、桔梗、沙参、石斛、忍冬藤等中药组合而成。是萍乡市中医院邱美和主任的经验方，并多年应用于临床的批文制剂。本方是以中医理论全面分析急慢性咽喉炎的病因，病机后，并结合了现代医学认识及中药药理研究成果而组成的一复方制剂。主要用于补肾，健脾，润肺，养血，活血生津，解毒，除烦，利咽，用于急慢性咽喉炎。其中忍冬藤有清热解毒消肿的功效[1]。有文献报道采用高效液相色谱法对咽舒乐颗粒中忍冬藤的有效成分绿原酸进行含量测定[2]。目前，咽舒乐颗粒的现行质量标准为《江西省食品药品监督管理局医疗机构制剂》GZJ-0293-（1）-2006，检验内容包括“性状、鉴别、检查”等，目前还没有含量测定的项目。为了使其更好的应用于临床，对其质量把控，提高质量标准，本实验选取咽舒乐颗粒中忍冬藤的主成分绿原酸为定量的指标，采用HPLC法测定绿原酸含量的方法研究。
1. 仪器、药品与试剂：
Agilent 1200型高效液相色谱仪：配1200四元低压梯度泵系列，Agilent1200化学工作站，DAD二极管阵列检测器。
绿原酸对照品来源（中国药品生物制品检定所提供，80℃减压干燥至恒重），批号：110753-201415 含量以96.2%计。水为超纯水，乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯。
2. 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Agilent 5TC-C18（250mm×4.6mm，5μm），流动相：以乙腈-0.4%磷酸（10：90），临用前以0.45?m微孔滤膜过滤并经超声脱气处理;检测的波长327nm;流速为1.0ml/min;柱温为25℃;进样量为10μl。理论板数按绿原酸峰计算应不低于1000。
2.2 溶液制备
2.2.1 对照品溶液的制备
取绿原酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含20?g的溶液，即得。
2.2.2 供试品溶液的制备
避光操作，取装量差异项下的内容物，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45?m微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
2.3 方法学考察
2.3.1 系统适用性实验
取对照品溶液、供试品溶液及空白溶剂，按2.1项下色谱条件测定，比较供试品溶液色谱、对照品色谱及空白溶剂色谱，结果供试品中绿原酸色谱峰有较好的色谱分离。
2.3.2 线性关系的考察
精密称取绿原酸对照品10.79mg，置100ml棕色量瓶中，加50%甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为绿原酸对照品母液，（10℃以下保存）;取母液再逐级稀释成2.076?g/ml、10.38?g/ml、20.76?g/ml、31.14?g/ml、41.52?g/ml的溶液，精密吸取上述对照品溶液及绿原酸对照品母液10μL注入液相色谱仪，以峰面积响应值Y为纵坐标，对照品浓度x为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程为Y= 30.328x -0.0053，R = 0.99998，说明绿原酸在2.076～41.52μg/ml之间有较好的线性关系。
2.3.3 精密度试验 精密吸取绿原酸对照品溶液（20.76μg/ml），按2.1项下色谱条件，重复进样6次，测定绿原酸峰面积RSD值为0.24%。表明精密度良好。
2.3.4 重复性试验
取同批样品（批号20160106），照2.3项下平行制备供试品溶液6份，照2.1项下色谱条件测定。结果绿原酸RSD为0.51%，表明此方法的重复性良好。
2.3.5加样回收率试验
精密称取已知含量的本品（批号20160106）6份，各约0.5g，置具塞锥形瓶中，分别精密添加对照品溶液（绿原酸对照品：10.38?g/ml）25ml，按2.1项下方法试验并算出回收率，结果见表1。
2.3.6 稳定性
精密吸取供试品溶液（批号20160106），分别在0、2、4、6、8、12h进样，按2.1项下色谱条件测定绿原酸的峰面积积分值，结果，绿原酸在12小时内峰面积无明显变化，RSD为0.16%（n=6），表明供试品溶液在12h内稳定。
2.3.7样品含量测定
取本品3批，照2.1项下方法试验，测定结果见表2。
根據结果，拟定本品每袋含忍冬藤以绿原酸（C16H18O9）计，不得少于0.82mg。
3. 讨论
本文参照《中国药典》2015年版一部[3]忍冬藤项下含量测定方法，选择327nm作为检测波长，选择乙腈-0.4%磷酸（10：90）为流动相，在此流动相条件下，组分的峰型及分离度均理想，同时未见其他成分干扰。因绿原酸见光易分解，考察了避光条件下与未避光条件下操作，结果避光条件下测得含量更大。
本文考察了甲醇、50%甲醇、稀乙醇，结果50%甲醇提取效率更高。参照《中国药典》2015年版一部忍冬藤项下含量测定方法，采用超声提取法，考察了超声提取20分钟、30分钟、40分钟，结果30分钟已提取完全。考察了20℃、25℃、30℃及35℃，结果25℃时峰面积最大。
本方法准确、快速，操作简便，专属性强，重现性好，可用于咽舒乐颗粒中绿原酸的含量测定。
参考文献：
[1] 余德洋.云南习用忍冬藤药材的化学成分研究[D].云南中医学院，
[2] 姜华，郭敏，徐世红，等.HPLC 法测定忍冬藤痛风颗粒中绿原酸的含量[J].西部中医药.2017，30（4）：25-27.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2015年版 一部）[M].北京：中国医药科技出版社.2015：129-130.