1965年1月13日，蒋介石正式颁布命令，特任蒋经国为“国防部长”。至此，蒋经国方才名副其实地掌握台湾的军权。虽然台湾的“国防组织法”规定，军队的统帅权由“参谋总长”和“国防部长”分享，然而在国民党政权的机构中，官职的权限大小，均因人而异。蒋经国出任“国防部长”后，“参谋总长”逐渐成为他的幕僚。
　　蒋经国任“国防部长”期间，深入基层，事必躬亲，把军事战备工作搞得热火朝天。他一方面积极在军中宣传“反攻大陆”，另一方面加强对大陆进行偷渡、空降、派遣和侦察飞行等活动，收集大陆情报。在他出任“国防部长”的第一年，派出的偷渡特务就达18批42人次，各种特务飞机对大陆的飞行达45批50架次。
　　“文化大革命”开始后，蒋经国密切关注大陆的政治、社会情势，他认为“现在这个时期，国内外整个世界局势，都有了很大的变化；可以说，这是我们18年以来，最重要的关头”，也是“反攻大陆”的最佳时机。
　　1967年，他曾准备利用“文化大革命”造成的混乱局势，以特种兵、空降兵为主袭击大陆。蒋经国制订的有关方案叫“王师”计划。根据1967年初提出的“王师一号计划”，国民党军队将对闽浙粤三省沿海地区和闽粤交界处实施“加强军”空降，两栖登陆作战、3个空降营和1个炮兵营、1个空军战斗机联队和1个运输机联队，外加所需的海军运输、巡航舰只。“王师二号计划”则是准备用30架C119运输机运送1个空降营和2个特种作战大队偷袭大陆。“王师三号计划”准备空降1个连和1个特种作战大队偷袭大陆。但由于美国的反对，蒋经国的“王师”计划最终未能付诸实施。
　　在出任“国防部长”期间，蒋经国还负责秘密研制原子弹。1964年，大陆第一颗原子弹爆炸成功后，蒋介石深恐台湾遭受大陆的核武器攻击，他在官邸与行馆修筑了钢骨结构并配备了厚钢门的防核防空洞，除了在军队中不断进行防止核生化攻击的战术操演外，还决心启动原子弹研制计划，与大陆展开竞赛。1965年4月，蒋介石指示成立“石门科学研究院筹备处”。7月1日，筹备处从台北市区搬到“石门营区”，全称也改为“中山科学研究院筹备处”，正式展开原子弹研制计划。蒋经国前后主持筹备处工作汇报19次，是原子弹研制计划的实际负责人。
　　在筹备期间，蒋介石企图邀请物理学家吴大猷指导原子弹的研制，并将发展原子弹的内部文件交给了吴大猷审核。然而，出乎蒋介石意料之外，吴大猷却认为台湾腹地狭小，在战略上不利于从事核子战争，因而强烈反对台湾发展核武器。蒋介石接到吴大猷的反对意见后非常生气，他在日记中说：
　　留美科学家如吴大猷者，自由不羁，只知自己个人威望，而不知国家利害，亦不审政情艰巨与国际环境，殊为可叹。此种成事不足，败事有余之学者，建设工作尚未开始而先被破坏，殊为可痛。
　　尽管遭到吴大猷的反对，蒋经国仍继续推行原子弹研制计划。1969年7月1日，“中山科学研究院”正式成立，设四个研究所：第一研究所主要负责研制原子弹；第二研究所研发火箭；第三研究所研究电子；第四研究所研发军用化学。此外，还设置了计划、设施供应、行政、主计等四个后勤支持组。然而，随着中美关系的改善，美国政府逐步调整了原先暗助与放任台湾发展核武器的政策，在美国的干预下，台湾发展核武的计划最终夭折。
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