【摘 要】
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目的 建立凝血因子Ⅷ(factor Ⅷ,FⅧ)基因剔除小鼠模型,为研究治疗血友病A提供理想的动物模型.方法应用ET克隆、胚胎干细胞同源重组和四倍体囊胚补偿技术,将小鼠FⅧ基因第16～19外显子靶向剔除,并应用PCR、逆转录PCR(reversetranscriptase-PCR,RT-PCR)及免疫组织化学染色技术,从DNA、RNA、蛋白水平检测FⅧ基因的转录及表达情况.通过检测激活的部分凝血活酶
【机 构】
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201210上海南方模式生物研究中心,上海交通大学医学院医学遗传学教研室,201210上海南方模式生物研究中心,上海交通大学附属瑞金医院,上海中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所,上海中国科学院
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目的 建立凝血因子Ⅷ(factor Ⅷ,FⅧ)基因剔除小鼠模型,为研究治疗血友病A提供理想的动物模型.方法应用ET克隆、胚胎干细胞同源重组和四倍体囊胚补偿技术,将小鼠FⅧ基因第16～19外显子靶向剔除,并应用PCR、逆转录PCR(reversetranscriptase-PCR,RT-PCR)及免疫组织化学染色技术,从DNA、RNA、蛋白水平检测FⅧ基因的转录及表达情况.通过检测激活的部分凝血活酶时间(activatedpartial thromboplastin time,APTT)和FⅧ的促凝活性(FⅧ∶C)进行FⅧ基因剔除小鼠表型鉴定.结果PCR检测在剔除小鼠中未扩增出FⅧ基因的条带;RT-PCR分析显示剔除区域该基因mRNA转录本缺失;免疫组织化学染色显示在雄性半合子(-/y)和雌性纯合子(-/-)小鼠的肝脏中凝血因子Ⅷ表达缺失;FⅧ∶C和APTT检测结果显示雌性杂合子(+/-)FⅧ活性为野生型(wt)的80%,其APTT值较wt略有延长,而-/y和-/-小鼠的FⅧ的活性仅为wt小鼠的8%和10%,且APTT值均大于120s.结论FⅧ基因剔除小鼠具有与人类血友病A患者相似的表型,它的建立将促进我国血友病A治疗新技术的发展。
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