激光诱导荧光检测中聚焦光斑对荧光强度的影响

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激光诱导荧光检测作为一种高灵敏度检测方式,在毛细管电泳中得到了广泛的应用,荧光物质在毛细管中的发光与普通的光源有很大不同,如何提高信号强度,完善电泳检测手段,是毛细管电泳中的重要问题。利用自行设计激光诱导荧光检测平台进行毛细管电泳实验,并按以往的思路,透镜将激发光准确聚焦到毛细管检测窗口的内径中部,使照射到毛细管内径的光斑最小,此时激发光最集中,激发功率密度最大,因此设想所获得的荧光信号会最大,本系统中,激光束通过透镜,焦面上光束直径为 10μm,毛细管内径50μm。但是实验结果并不理想,样品电泳后的荧光信号强度较低。由于荧光物质在毛细管中是受激发光,我们构想增大照射到毛细管内径的光斑大小,以提高荧光物质的激发体积,那么光电倍增管前接收到的荧光信号可能会提高,信噪比随之也会提高。首先,利用光学仿真软件,将激光光源、二色镜、带小孔反射镜、f-theta物镜、反射镜、会聚镜以及毛细管按照实验原理图及实验光路尺寸在光学软件中建立了一个系统模型。实验中所用到的荧光染料是EB(溴化乙啶),它在532nm的激光下激发出595nm的荧光,定义荧光波长为595nm,且向周围各个方向均匀发射。如果改变聚焦到毛细管内径的光斑大小,这个体光源的体积会改变,模拟光电倍增管所接收到的荧光信号。结果表明:增大照射到毛细管内径的光斑大小,光电倍增管接收到的荧光信号是增大的。用标准样品pGEM-3Zf(+)/Hae Ⅲ Markers进行毛细管电泳检测,实验的结果也验证了仿真结果的正确性。
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