论文部分内容阅读
【目的】研究DEHP引起雄性幼鼠睾丸毒性及其具体分子机制,探讨DEHP引起大鼠睾丸细胞凋亡的信号通路以及对DNA复制、细胞线粒体功能、SIRT1活性以及NAD~+水平的影响。【方法】利用刚断乳雄性SD大鼠模型观察DEHP的抗雄激素效应,观察不同剂量DEHP(0,20,100,500mg/kg)对大鼠雄激素依赖组织如睾丸、附睾、前列腺、精囊腺、LABC以及肛门生殖器距离AGD等指标的影响;H&E染色观察大鼠睾丸组织病理学改变,TUNEL检测大鼠睾丸核DNA断裂情况;蛋白免疫印迹检测DEHP引起大鼠睾丸细胞凋亡的信号通路相关蛋白如caspase-3、caspase-9、caspase-8、PARP-1,Bcl-XL,Bid,Bak,Bax,以及SIRT1、PGC-1α、乙酰化p53、p53、PARP以及氧化磷酸化复合物的蛋白表达;DNA fiber检测DEHP对大鼠睾丸间质细胞等DNA复制的影响;流式细胞术检测DEHP对小鼠睾丸细胞等胞内ROS、线粒体ROS水平的影响;运用化学发光以及酶联免疫法检测DEHP对小鼠睾丸间质细胞ATP水平以及NAD~+水平的影响。【结果】DEHP显著降低刚断乳SD雄性幼鼠的雄激素依赖组织,如睾丸、附睾、前列腺、精囊腺以及LABC组织重量并引起大鼠肛门生殖器距离明显减小,具有显著的抗雄激素作用。DEHP引起睾丸组织精母细胞、精子细胞数量明显减少;TUNEL检测结果显示DEHP处理能够引起大鼠睾丸组织细胞出现核DNA断裂。DEHP暴露引起大鼠睾丸组织中caspase-3,caspase-8以及caspase-9的蛋白表达明显增加,同时引起Bcl-2家族蛋白抑凋亡Bcl-XL蛋白表达明显降低,促凋亡蛋白Bid、Bax、Bak表达明显升高。DEHP能够显著抑制睾丸间质细胞CRL-2714 DNA复制。DEHP处理引起多种睾丸细胞以及非睾丸细胞3T3细胞活性氧ROS以及线粒体ROS显著升高。DEHP处理能够显著降低小鼠睾丸间质细胞NAD’水平。DEHP显著降低睾丸组织中SIRT1以及PGC-1α蛋白表达以及p53表达以及去乙酰化p53蛋白的表达明显升高。DEHP能够显著降低细胞ATP水平。DEHP暴露降低睾丸组织的氧化磷酸化产物Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ和Ⅴ的表达。【结论】DEHP具有明显的抗雄激素作用,引起刚断乳雄性SD幼鼠的睾丸损伤;DEHP引起睾丸内源性细胞凋亡以及细胞线粒体功能损伤可能与其引起多聚ADP核糖聚合PARP反应,导致NAD+过度消耗,进而损伤SIRT1活性有关。SIRT1活性降低、线粒体功能损伤和DNA复制抑制可能参与DEHP引起的睾丸毒性过程。SIRT1在男性生殖过程中可能具有重要作用。