【摘 要】
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目的 筛选DMF(N,N-二甲基甲酰胺)诱导肝细胞凋亡过程中差异表达的关键miRNA 分子,并阐明其作用机制,为DMF 职业中毒的诊断和治疗提供理论参考.方法 HL-7702 细胞,随机分为0,18.75,37.5,75,150mM 浓度DMF 剂量组进行48h 染毒.流式细胞仪检测细胞凋亡率,蛋白免疫印迹法检测caspase 3 蛋白的表达水平.提取0、75、150mM DMF 剂量组的细胞总R
【机 构】
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中山大学公共卫生学院毒理学系,广州,510080 广州市疾病预防控制中心,广州,510440
【出 处】
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中国毒理学会表观遗传毒理专业委员会第一次学术大会
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目的 筛选DMF(N,N-二甲基甲酰胺)诱导肝细胞凋亡过程中差异表达的关键miRNA 分子,并阐明其作用机制,为DMF 职业中毒的诊断和治疗提供理论参考.方法 HL-7702 细胞,随机分为0,18.75,37.5,75,150mM 浓度DMF 剂量组进行48h 染毒.流式细胞仪检测细胞凋亡率,蛋白免疫印迹法检测caspase 3 蛋白的表达水平.提取0、75、150mM DMF 剂量组的细胞总RNA 进行高通量转录组测序,生物信息学分析筛选差异表达的miRNA、预测miRNA 的下游作用靶点.qRT-PCR 检测miRNA 及其靶基因mRNA 水平.双荧光素酶报告基因实验检测miRNA 与下游靶基因的相互作用.30 只7-8 周龄的ICR 雄性小鼠,随机分成0,500,1000ng/m3 3 个剂量组进行28 天静式吸入DMF 染毒,6h/天.收集小鼠血液、尿液及组织样本,分别检测血生化指标、肝脏病理HE 染色和TUNNEL 染色等.结果 DMF 染毒后,HL-7702 细胞凋亡率和Caspase 3 蛋白剪切体的表达呈剂量依赖性升高.高通量测序结果显示DMF 染毒后miR-192-5p 的差异上调最为显著,并且与qRT-PCR 实验结果一致.miR-192-5p 过表达质粒和抑制剂分别能上调HL-7702 细胞的凋亡水平和降低染毒条件下HL-7702 的凋亡水平.生物信息学预测NOB1 是miR-129-5p 的下游靶基因,经细胞实验和动物验证NOB1 在DMF 染毒后表达下调,miR-129-5p 抑制剂和过表达质粒可分别上调和下调NOB1 的表达水平,miR-129-5p 显著抑制NOB1 3UTR 区的荧光素酶活性.NOB1 敲低和过表达分别增加细胞凋亡水平和减缓DMF 诱导的凋亡.染毒小鼠病理学检测和血生化指标显示显著的肝损伤改变.染毒小鼠中miR-192-5p 与NOB1 的表达水平与体外细胞染毒结果一致.结论 DMF 通过上调miR-192-5p 从而抑制NOB1 表达继而促进细胞凋亡来诱导肝毒性.该工作在miRNA 水平上提供了DMF 诱导肝细胞凋亡的分子机制.
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