【摘 要】
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本研究旨在克隆柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)基因,并初步分析EtDXR的酶活性.根据EuPathDB数据库信息注释、拼接Etdxr基因序列,根据注释序列设计特异性扩增引物,以E.tenella第二代裂殖子总RNA为模板,RT-PCR方法扩增Etdx
【机 构】
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广东省农业科学院动物卫生研究所,广东省畜禽疫病防治研究重点实验室,广东省兽医公共卫生公共实验室,广东,广州 510640
【出 处】
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中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会
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本研究旨在克隆柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)基因,并初步分析EtDXR的酶活性.根据EuPathDB数据库信息注释、拼接Etdxr基因序列,根据注释序列设计特异性扩增引物,以E.tenella第二代裂殖子总RNA为模板,RT-PCR方法扩增Etdxr基因.构建原核表达质粒pCold Ⅰ-EtDXR,转化E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况,利用亲和层析法纯化His-rEtDXR,并进行Western blot分析.采用直接检测底物消耗速率的方法,以Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪在激发波长340 nm和发射波长460 nm测定的相对荧光值(RFU)检测NADPH降解速率,以测定rEtDXR的酶活性,同时分析pH值和Mg2+离子浓度对酶活性的影响.结果显示,Etdxr基因完整编码序列1 746 bp.EtDXR与其它物种DXR氨基酸序列具有保守的酶活性位点,经比对分析,推测EtDXR与Toxoplasma gondii DXR、Plasmodium falciparum DXR基因类似,存在转导肽序列.SDS-PAGE分析显示,rEtDXR诱导表达成功,相对分子量为50 kDa；Western blot分析显示,获得纯化的His-rEtDXR.rEtDXR酶活性分析发现不同pH值和离子浓度对EtDXR的酶活性有显著影响,其最佳的酶反应条件为pH 7.0,Mg2+离子浓度4.5 mM.根据酶动力学分析结果,rEtDXR对1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate,DXP)的Km=15.41±3.11 μM,Vmax=1.33±0.049mmol/min/mg.本研究成功克隆E.tenella dxr基因,初步分析EtDXR的酶活性,建立了EtDXR的酶动力学反应体系,为进一步以E.tenella5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶为药靶筛选抗球虫先导化合物奠定了基础.
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