【摘 要】
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目的 阐明4-t-辛基酚(OP)暴露后大鼠睾丸功能改变与其相关凋亡信号激活的分子机制.方法 1)将成年雄性SD大鼠随机分成对照组和染毒组(1/90 LD50,1/30 LD50和1/10LD50),染毒剂量为：对照组0 mg·kg-1 ·d-1)、低剂量组50 mg· kg-1·d-1、中剂量组150 mg· kg-1·d-1)和高剂量组450 mg· kg-1·d-1,每天灌胃染毒,每周染毒6d
【机 构】
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江苏省疾病预防控制中心毒理与功能评价所,江苏南京210009 南京医科大学应用毒理研究所,江苏南京
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目的 阐明4-t-辛基酚(OP)暴露后大鼠睾丸功能改变与其相关凋亡信号激活的分子机制.方法 1)将成年雄性SD大鼠随机分成对照组和染毒组(1/90 LD50,1/30 LD50和1/10LD50),染毒剂量为：对照组0 mg·kg-1 ·d-1)、低剂量组50 mg· kg-1·d-1、中剂量组150 mg· kg-1·d-1)和高剂量组450 mg· kg-1·d-1,每天灌胃染毒,每周染毒6d.连续染毒4周(2个生精周期)后,处死大鼠,迅速分离睾丸等脏器.2)对照组和OP染毒150 mg·kg-1 ·d-1组大鼠睾丸组织总RNA提取并纯化后,与约含15 900个大鼠全基因组的Affymetrix Genechip RAT 230A寡核苷酸芯片进行杂交,快速、并行、高效地检测睾丸组织中基因的转录水平,考察基因的应答特征.3)用定量PCR(RT-PCR)法验证差异表达基因,并从中选出与凋亡密切相关的2个基因,用TaqMan-MGB探针技术实时观察对照组和各染毒剂量组凋亡基因mRNA水平的变化.4)用Western blot的方法验证凋亡相关基因的蛋白表达水平变化,以及睾丸组织中细胞色素C(Cyto C)的释放水平、促凋亡基因Bax的表达水平改变以及胱天蛋白酶3的激活状态.结果 1)评估了基因芯片技术分析大鼠睾丸受到OP作用之后mRNA表达水平的改变应答,得到满足差异基因判定标准("Signal Log Ratio"一栏中log2值≥0.7或≤-0.7)的112个探针组(probe set),其中表达上调的基因19个,表达下调的基因93个.2)用RT-PCR法检测了对照组和各染毒剂量组(50,150和450 mg·kg-1 ·d-1大鼠睾丸组织的Bcl-x,DED和YWK Ⅱ基因mRNA水平的表达变化,这3个基因都是在芯片中差异表达的基因,并从中选出与凋亡相关的2个关键基因(Bcl-x和DED),用TaqMan-MGB探针技术实时观察对照组和各染毒剂量组凋亡基因mRNA水平的变化.一方面,基因芯片、RT-PCR、Real time PCR三种方法得出的基因表达变化在趋势上是一致的；另一方面,所检测的Bcl-x,DED和YWK Ⅱ基因随染毒剂量的增加,表达水平逐渐下降,且450 mg· kg-1·d-1剂量组显著低于对照组.3)Western Blot结果表明,随着OP染毒剂量的增加,Cyto C的释放随之增加,激活型Bax的表达增加,Bcl-x表达下降,胱天蛋白酶3激活.结论 OP可引起大鼠睾丸组织多种基因mRNA水平表达的改变.凋亡相关基因Bcl-x、DED基因的mRNA表达水平随OP染毒剂量的增高逐渐降低,Cyto C的释放、胱天蛋白酶3的激活、激活型Bax表达增加,提示内源性凋亡通路的激活.
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