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目的:为了调查骨折愈合过程中,甲状旁腺激素对促进血管形成的影响,给静脉注射干细胞随后连续运用PTH治疗股骨骨折小鼠进行了定量显微CT扫描,并应用连续的免疫组织化学(IHC).
方法:选取8周大的右股骨骨折稳定期的C57BL/6雌性小鼠进行实验,共分为四组:(1)(0.9％盐水),(2)105hMSCsIV,(3)PTH40ug/kg/天皮下运用14天,(4)105hMSCsIV+PTH40ug/kg/天(14天).在第14天,用氯胺酮和甲苯噻嗪将小鼠安乐死,随后灌注铅基铬酸盐染料Microfil(R)MV-120(Flowtech公司制),以显示骨折愈合组织内的毛细血管.在脱钙前后,分别用显微CT(VivaCT40,SCANCO美国公司)来量化的新骨和血管系统的体积.由显微CT三维重建来分析新骨痂的血管分布,其次是抗CD31,VEGF,VEGFR1组织学确认和VEGFR2的免疫组化分析.用Visiopharm(R)成像软件定量测定CD31,VEGF,VEGFR1和VEGFR2在骨小梁骨髓间充质组织和软骨组织中的表达水平.(1)PTH显著增加骨痂以及小血管的总体积和质量:显微CT分析和3-D重建表明空白对照组或单独用hMSCs组相比,PTH和(36.8±5.0立方毫米)加或不加的hMSC(34.9±6.1立方毫米)组总的骨量有显著增加(P＜0.05).
结果:在hMSC组,PTH或PTH+hMSCs组骨小梁数量均显著增加.但是在分离所有骨质密度(BMD),骨小梁厚度没有显著差别.同时通过ABG/H染色,组织学确认软骨,织状骨和骨髓间质组织的显示了类似的结果.为了研究这些IVhMSCs导致破裂损伤部位进一步有助于血管形成,血管灌注的显微CT的三维重建基于直径的不同分为三组,分别为(1)＜0.065毫米,(2)0.065毫米0.15毫米,和(3)＞0.15毫米.有趣的是所有的hMSCs和/或甲状旁腺素治疗组血管的总数目显著增加,但只有小血管(＜0.065毫米)在PTH处理组显著增加.(2)PTH显著增强CD-31,VEGF,VEGFR1,VEGFR2在内部的骨小梁,间质组织和软骨中的表达.为了进一步探索血管在hMSCs和/或甲状旁腺激素治疗的中增加的原因,进行血管发生分化分析,发现PTH可以显著促进hMSCs分化(数据未显示).然后IHC被用于血管生成相关因子CD-31,VEGF,VEGFR1,和VEGFR2染色.在PTH和/或处理的hMSCs的骨小梁和间叶组织CD-31的高度表达,但没有在软骨中表达出来.PTH和hMSCs组合使CD-31急剧增加,血管内皮生长因子和VEGFR1在间质组织的表达,但VEGFR2没有表达.
结论:甲状旁腺激素诱导的IVhMSCs在骨折修复中显著增加总骨量.它可以通过促进静脉的hMSCs进行血管分化增加毛细血管的形成.其分子机制仍在研究中.