【摘 要】
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目的：克隆C57BL/6鼠CAR基因,与pEGFP-C1质粒载体连接,转染原代培养的C57BL/6乳鼠心肌细胞,检测CAR的表达.方法：查找CAR基因序列,根据CAR基因开放阅读框架设计合适引物.提取C57BL/6胎鼠心脏总RNA,逆转录合成cDNA,利用引物5′-CCTCTAGACCCAGCCGAGATCGTTT-3′和5′-CCGTCGACAAGAAACGAGCCACGGAC-3′扩增CAR基
【机 构】
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哈尔滨医科大学第二附属医院心血管内科 哈尔滨医科大学组胚教研室
【出 处】
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中华医学会第十五次全国心血管病学大会
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目的：克隆C57BL/6鼠CAR基因,与pEGFP-C1质粒载体连接,转染原代培养的C57BL/6乳鼠心肌细胞,检测CAR的表达.方法：查找CAR基因序列,根据CAR基因开放阅读框架设计合适引物.提取C57BL/6胎鼠心脏总RNA,逆转录合成cDNA,利用引物5′-CCTCTAGACCCAGCCGAGATCGTTT-3′和5′-CCGTCGACAAGAAACGAGCCACGGAC-3′扩增CAR基因,通过XbaI和SalI酶切后纯化,与pBluescriptⅡKS+载体连接,进行转化、蓝白筛选及测序鉴定,构建pBlue-CAR 载体.从所得载体上利用引物5-GGCTCGAGGTatggcgcgcctactgtgc-3‘和5‘-CCGAATTCTATACTATAGACCCGTC-3‘扩增CAR基因，通过XhoI和EcoRI酶切后纯化连接至pEGFP-C1载体，构建重组质粒pEGFP-CI-CAR，经PstI酶切线性化后进行测序鉴定。实验设置2个处理组，经测序鉴定正确的阳性克隆采用LipofectamineHP转染原代培养的C57BL/6乳鼠心肌细胞作为pEGFP-CI-CAR载体转染组，以pEGFP-C1空载体转染心肌细胞作为对照组，分别在于转染后12h,24h,48h,72h，采用RT-qPCR及Western-Blot鉴定其在心肌细胞的表达，倒置荧光显微镜观察EGFP的表达，计算转染效率。结果:得到pEGFP-CI-CAR基因序列。倒置荧光显微镜观察发现转染后24h乳鼠心肌细胞表达EGFP,转染效率达20％。RT-qPCR及Western-Blot示小鼠心肌细胞pEGFP-C1-CAR载体转染后24h CAR表达明显升高。结论：成功克隆C57BL/6鼠CAR基因并构建pEGFP-C:1-CAR真核表达载体，且在小鼠心肌细胞的表达获得成功，为进一步研究CAR在病毒性心肌炎发病机制中的作用奠定了基础。
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