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西红花,又称藏红花,为鸢尾科植物番红花CrocussativusL,的干燥柱头,是一味名贵中药。其具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神等功效,用于经闭、产后瘀血、抑郁、心悸、癫狂等治疗。番红花花瓣（C.sativus petal,CSP）是西红花生产过程中的副产物,产量高,资源丰富。实验室前期研究表明:CSP水提物具有免疫调节活性。本课题在此基础上,利用现代柱色谱方法,从中分离、纯化得到番红花花瓣多糖（C.sativus petal poly saccharides,CSPPs）A（CSPPA）和B（CSPPB）,并采用多种光谱、波谱技术,结合化学分析方法对二种均一多糖的结构进行了表征。以卵清蛋白（OVA）和口蹄疫疫苗为抗原,研究了其佐剂作用及其机制。同时,采用RAW264.7细胞模型,评价二种均一多糖体外对巨噬细胞的免疫调节作用,并探讨其作用机制。1.番红花花瓣多糖的分离、纯化和结构表征采用水提醇沉法提取番红花花瓣粗多糖,经脱色、除蛋白后,DEAE SephadexA50柱色谱分成F1、F2和F3三个流份;F2和F3继续以SephadexG200柱色谱纯化,分别得到两个均一多糖,即CSPPA和CSPPB。高效凝胶渗透色谱（HPGPC）分析结果表明:CSPPA和CSPPB峰形对称,分散系数分别为1.14和1.21;分子量分别为1.98×106和2.53×106Da。红外光谱（IR）分析结果表明:CSPPA和CSPPB具有多糖特征吸收峰,含有乙酰基和磺酸基。CSPPA的总糖、磺酸基和氧乙酰基含量分别为95.33%、7.95%和5.10%;CSPPB的总糖、磺酸基和氧乙酰基含量分别为93.22%、13.02%和3.33%。CSPPA由半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖（摩尔比16:5:7:3）组成;CSPPB由半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖（摩尔比16:2:7:19:15:16）组成。综合甲基化分析、Smith降解产物和NMR 数据,CSPPA 单糖残基包括→4)-Me-β-D-GalpA-(1→、α-L-Rhap-（1→、→3,6）-β-D-Galp-（1→、→4）-α-L-Arap-（1→、→4）-β-D-Xylp-（1→和→3,4）-β-D-Xylp-（1→。乙酰基和磺酸基取代糖残基为→3,6）-2-OAc-β-D-Galp-（1→、→3,6）-4-OAc-β-D-Galp-（1→和→4）-3-SO3-β-D-Xylp-(1→。CSPPB 单糖残基包括 α-L-Araf-（1→、→2）-α-L-Arap-（1→、→3）-β-D-Galp-(1→、Me-β-D-GalpA-（1→、→4）-α-L-Rhap-（1→、→4）-3-SO3-α-L-Rhap-（1→、→3,4）-α-L-Rhap-（1→、→6）-β-D-Manp-（1→、→6）-2-OAc-β-D-Manp-（1→、→4）-3-SO3-β-D-Xylp-（1→、→4）-β-D-Xylp-（1→、→3,4）-β-D-Xylp-（1→、→6）-β-D-Glcp（1→、→6）-3-OAc-β-D-Glcp-（1→和→3,6）-β-D-Glcp(1→等14种单糖残基组成。刚果红实验结果表明:CSPPA在水溶液中形成三螺旋结构。扫描电镜观察结果显示:CSPPA和CSPPB均存在片状、棒状及鳞片状结构。原子力显微镜观察发现CSPPA存在多糖链自发卷曲形成的岛状结构,其表面起伏较CSPPB大。CSPPA和CSPPB在单糖组成、残基类型、高级结构和微观结构等方面均存在差异。2.番红花花瓣多糖的免疫佐剂作用及其机制研究CSPPA和CSPPB分别联合OVA或FMDV 146S免疫小鼠2次,间隔二周。加强免疫后14d,分离血清和制备脾细胞悬液,检测受免小鼠血清中抗原特异性IgG及其亚类抗体效价、脾细胞增殖反应、NK细胞活性、脾细胞细胞因子分泌能力、以及细胞因子和转录因子基因表达水平。CSPPA和CSPPB不仅能显著提高OVA和FMDV 146S免疫小鼠血清中抗原特异性IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b抗体水平,而且可显著促进受免小鼠ConA、LPS和抗原特异性刺激脾细胞增殖反应,及增强NK细胞杀伤活性（P<0.05、P<0.01或P<0.001）。同时,CSPPA和CSPPB可显著诱导免疫小鼠刺激原或抗原特异性刺激脾细胞分泌IFN-y和IL-10,上调OVA免疫小鼠抗原特异性刺激脾细胞Th1（IL-2、IFN-γ、T-bet和STAT4）和Th2（IL-4、IL-10、GATA3和STAT6）细胞因子和转录因子mRNA表达水平（P<0.05、P<0.01或P＜0.001）。这些结果表明,CSPPA和CSPPB均具有显著的免疫佐剂活性,能增强受免小鼠特异性体液免疫和细胞免疫反应,诱导均衡的Th1和Th2免疫应答,是理想的疫苗候选佐剂。诱导免疫部位局部组织先天性免疫反应是当前佐剂机制研究的重要方向之一。采用H&E染色、流式细胞术、RT-qPCR和ELISA观察和检测CSPPA和CSPPB肌内注射对小鼠股四头肌组织先天性免疫微环境的影响。CSPPA和CSPPB可引发股四头肌组织炎性浸润,诱导炎性因子（IL-1β、IL-6、CCL3、CXCL1和CXCL2）产生;显著上调炎性细胞因子（IL-1β 和 IL-6）和趋化因子（CCL3、CXCL1 和 CXCL2）的 mRNA 表达水平（P<0.05,P＜0.01或P<0.001）。同时,CSPPA和CSPPB可显著促进小鼠股四头肌组织中性粒细胞、树状细胞和巨噬细胞的募集及抗原摄取能力,提高淋巴结中树状细胞、B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞和T细胞等免疫细胞数量（P<0.05）。这些结果表明:CSPPA和CSPPB肌注可快速诱导小鼠注射部位局部组织免疫细胞募集,改善局部组织先天性免疫微环境,最终调控抗原特异性适应性免疫应答。3.番红花花瓣多糖对RAW264.7细胞的免疫调节作用及其机制研究以RAW264.7为细胞模型,研究CSPPA和CSPPB体外对巨噬细胞的免疫调节作用。CSPPA和CSPPB对RAW264.7细胞的最大无毒性浓度均为5 μg/mL。CSPPA和CSPPB可浓度依赖性显著诱导RAW264.7细胞分泌细胞因子（IL-1β、IL-10、IL-12p40和TNF-α）和趋化因子（CCL5和CCL22）,以及上调这些细胞因子和趋化因子的mRNA表达（P<0.05、P<0.01或P<0.001）。CSPPA和CSPPB也能显著促进RAW264.7细胞吞噬能力以及表面分子和共刺激分子（CD40、CD80、CD86、MHCI和MHCII）的表达（P<0.05、P<0.01或P<0.001）。进一步研究发现,CSPPA和CSPPB可显著促进RAW264.7细胞MAPK 家族 ERK、JNK 和 MAPK p3 8 以及 NF-κB p65 的磷酸化。p3 8 MAPK 抑制剂 SB203 5 8 0和NF-κB p65抑制剂Bay 11-7082能显著抑制CSPPA诱导RAW264.7细胞IL-10和IL-12 p40的分泌（P<0.001）,而JNK抑制剂SP600125和ERK抑制剂PD98059则显著抑制CSPPB诱导RAW264.7细胞IL-10和IL-12p40的分泌（P<0.01或P<0.001）。这些结果说明:CSPPA和CSPPB均可通过MAPK和NF-κB通路激活RAW264.7细胞。综上所述,本研究从番红花花瓣中分离、纯化得到两个均一多糖CSPPA和CSPPB,并对其理化性质和一级结构进行了表征。CSPPA和CSPPB可通过快速诱导免疫部位局部组织先天性免疫应答以及MAPK/NF-κB通路激活APCs,发挥免疫佐剂作用,是理想的候选疫苗佐剂,具有良好的开发研究前景。研究结果为番红花花瓣的开发利用提供科学依据。