论文部分内容阅读
目的：探讨MAPK家族P38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和c-Jun氨基端激酶(JNK)信号通道在TGF-β1诱导的人肺泡上皮细胞上皮-间质转分化(EMT)中的意义,以及沙利度胺对肺泡Ⅱ型上皮细胞的EMT的作用以及对MAPK家族成员JNK、P38MAPK的影响,从而进一步揭示肺纤维化的发病机制,阐明沙利度胺抗肺纤维化的机理,为肺纤维化的治疗寻找新的切入点。方法：第一部分A549细胞在含TGF-β1(3ng/ml)的培养基培养48小时,从而诱导A549细胞上皮间质细胞转分化(EMT); JNK特异抑制物(SP-600125)预处理1小时,P38MAPK特异抑制物(SB-203580)预处理1小时,然后在含3ng/ml TGF-β1培养基培养48小时；基因沉默组在shRNA转染成功后在含3ng/ml TGF-β1培养基培养48小时。磷酸化的p38MAPK、JNK蛋白和mRNA检测在TGF-β1处理30min后进行,细胞形态评估、细胞标志蛋白以及mRNA的检测在TGF-β1培养基培养48小时后进行。所有组做A549细胞形态评估,并通过免疫印迹法(western blotting)检测A549细胞磷酸化p38MAPK和JNK的蛋白,以及间质细胞表型蛋白包括结蛋白(desmin)、波形蛋白(vimentin)、α-肌动蛋白(a-SMA)和上皮细胞表型蛋白包括E-钙粘素(E-cadherin)、紧密连接蛋白(zonula occludens-1,ZO-1)、水通道蛋白-5(aquaporin-5,AQP-5)的表达。基因沉默组还需通过实时荧光定量PCR方法检测A549细胞的P38MAPK和JNK的mRNA.第二部分沙利度胺溶解于二甲基亚砜(DMSO),A549细胞分为3组：A：对照组；B:TGF-pl+DMSO组(DMSO提前预处理24小时,然后给予TGF-β1); C: TGF-β1+沙利度胺组(沙利度胺含量为10μg/ml,提前预处理24小时,然后给予TGF-β1)；TGF-β1含量为3ng/ml,孵育48h,磷酸化的p38MAPK、JNK蛋白和mRNA检测在TGF-β1处理30min后进行,细胞形态评估和细胞标志蛋白的检测在含TGF-β1培养基培养48小时后进行。所有组行A549细胞形态评估,并通过免疫印迹法(western blotting)检测A549细胞磷酸化p38MAPK和JNK的蛋白,以及间质细胞表型蛋白包括desmin、vimentin、α-SMA和上皮细胞表型蛋白包括E-cadherin、ZO-1、AQP-5的表达。结果：第一部分A549细胞在TGF-β1诱导48小时后表现出类成纤维细胞表型,细胞间连接减少。TGF-β1显著减少肺泡上皮细胞的上皮标志物E-钙粘素、ZO-1和AQP-5的表达(p<0.05),与此对应的是增加成纤维细胞标志物α-SMA、desmin和vimentin的表达(p<0.05)。TGF-β1显著增加A549细胞磷酸化的p38MAPK和磷酸化的JNK蛋白的表达(p<0.05);JNK的特异抑制剂SP-600125和p38MAPK特异抑制剂SB-203580,均可以抑制A549细胞向间质细胞转分化,显著抑制(p<0.05)TGF-β1诱导的A549细胞α-SMA、结蛋白和波形蛋白表达,与此对应的是可阻止(p<0.05) TGF-β1诱导的A549细胞E-钙粘素、ZO-1和AQP-5减少,显著减少活性MAPK蛋白(磷酸化的JNK和磷酸化的p38MAPK)的表达(p<0.05);p38MAPK和JNK基因沉默均可以抑制A549细胞向间质细胞转分化,可以显著抑制TGF-β1诱导的A549细胞α-SMA、结蛋白和波形蛋白表达(p<0.05),与此对应的是可阻止TGF-β1诱导的A549细胞E-钙粘素、ZO-1和AQP-5减少(p<0.05),可以显著减少p38MAPK和JNK mRNA和蛋白表达(p<0.05)第二部分沙利度胺可以抑制TGF-β1诱导A549细胞向间质细胞转分化,显著抑制(p<0.05) TGF-β1诱导的A549细胞α-SMA、结蛋白和波形蛋白表达,与此对应的是可阻止(p<0.05)TGF-β1诱导的A549细胞E-钙粘素、ZO-1和AQP-5减少,显著减少活性MAPK蛋白(磷酸化的JNK和磷酸化的p38MAPK)的表达(p<0.05)。结论：1.TGF-β1可诱导A549细胞向间质细胞转分化；2. p38MAPK和JNK信号通道在TGF-β1诱导的A549细胞上皮-间质转分化过程起重要作用；3.沙利度胺可能通过抑制p38MAPK和JNK信号通道,从而抑制肺泡上皮细胞的上皮-间质转分化过程而发挥抗纤维化作用。