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有机酸的含量和组分是决定果实风味品质的重要因素。有机酸在果实中参与了光合作用、呼吸作用,以及酚类、氨基酸、酯类和芳香物质的合成代谢,直接影响果实的采后品质和耐贮性。研究果实采后有机酸变化规律和调控机制,对阐明果实采后品质保持与调控的分子基础,提高和改善果实品质具有重要意义。本研究以苹果和模式材料番茄为研究对象,通过生理生化、分子生物学、蛋白质组学和细胞生物学等手段,分析了果实采后贮藏过程中的有机酸变化规律,发现了有机酸代谢途径的重要调控因子,为揭示果实采后有机酸代谢的调控机制提供了新证据。研究结果包括以下几个方面: 1.1-MCP对苹果果实采后有机酸代谢的调控作用:1-甲基环丙烯(1-MCP)处理苹果可延缓果实贮藏期间可滴定酸(TA)、苹果酸以及柠檬酸含量的下降。酶活力分析表明,1-MCP提高了苹果酸合成相关酶(cyNAD-MDH和PEPC)的活性,降低了苹果酸降解相关酶(PEPCK和cyNADP-ME)的活性,同时增强了液泡膜质子泵(V-ATPase和V-PPase)的活性。RT-qPCR分析进一步证实了1-MCP能在转录水平上调控这些酶基因的表达,由此说明,1-MCP是通过调控苹果酸代谢相关酶的基因表达,影响其活性来维持果实贮藏期间有机酸的含量。 2.液泡膜蛋白对苹果果实采后有机酸代谢的调控作用:建立并优化了苹果果实液泡膜蛋白质组学研究方法。利用iTRAQ定量蛋白质组学分析了苹果果实在贮藏过程中液泡膜蛋白的变化,结果共鉴定到345个液泡膜相关蛋白,其中有22个蛋白在常温贮藏过程中发生显著变化,包括糖酸转运、质子泵、信号转导、逆境应答、囊泡运输和膜脂过氧化相关蛋白。RT-qPCR检测结果表明大多数差异蛋白的mRNA水平与蛋白表达水平相一致。上述结果说明,液泡膜蛋白可能参与苹果果实贮藏过程中有机酸代谢调控。 3.番茄苹果酸转运蛋白基因功能研究:以cDNA为模板,从番茄中克隆了一个苹果酸转运蛋白(命名为SlTDT),提交序列至NCBI数据库(GenBank登录号KC733165)。生物信息学分析发现SlTDT蛋白含有13个跨膜结构域;通过与GFP融合表达,证实SlTDT蛋白定位于液泡膜。RT-qPCR检测结果表明SlTDT基因在番茄根、茎、叶、花和果实中均有表达,其中在叶片中表达量最高,说明SlTDT可能参与了番茄各个组织器官的生长发育。为了进一步研究该基因的生物学功能,构建了其过表达载体pBI121-SlTDT和RNAi干扰表达载体pK7G-SlTDT,并通过农杆菌介导的番茄遗传转化方法,成功获得了SlTDT过表达及干扰表达的植株。GC-MS分析表明,过表达果实的苹果酸含量提高,柠檬酸含量降低,而干扰表达果实与之相反,说明SlTDT在番茄苹果酸和柠檬酸转运过程中发挥重要功能。