四种葱蒜类蔬菜叶绿体DNA提取优化及比较基因组学研究

来源 :吉林农业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:konglingdao
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本试验以葱蒜类大葱(Allium fistulosum L.)、大蒜(Allium sativum L.)、洋葱(Allium cepa L.)、韭菜(Allium tuberosum Rottl.ex spr.)四种蔬菜为试验材料,对叶绿体DNA(chloroplast DNA,cpDNA)提取方法进行优化,并对其叶绿体DNA进行高通量测序和比较基因组学研究,结果如下:(1)以大葱叶片为试验材料,采用高盐低pH值法和蔗糖DNase法,对其进行叶绿体DNA提取。结果表明,高盐低pH法优于蔗糖DNase法,其DNA纯度相似,OD260/OD280值分别1.984和1.977;产率差异大,分别为0.482μg/g和0.059μg/g,高盐低pH值法是蔗糖DNase法产率的8.17倍。设计叶绿体MatK、线粒体Atp6和核LFY基因引物,比较三种细胞器DNA的拷贝数的比值,结果表明高盐低pH法提取叶绿体DNA含量是试剂盒法的130.56倍,蔗糖DNase法是试剂盒法的5.57倍,高盐低pH法是蔗糖DNase法的23.43倍。上述结果表明,高盐低pH法提取的叶绿体DNA产率和含量均优于蔗糖DNase法。随后用高盐低pH法对洋葱、大蒜和韭菜进行叶绿体DNA提取,仍获得了较高的产率和纯度。(2)以大葱为试验材料,进行四种葱蒜类蔬菜作物的cpDNA纯度优化试验。通过利用不同浓度盐离子试剂(1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L、2.5 mol/L、3.0 mol/L)提取cpDNA并对纯度进行分析,结果表明1.5 mol/L为最适盐离子浓度;Percoll密度梯度及离心力筛选试验表明:3200g为最适离心力;Percoll密度为50%时,完整的叶绿体会漂浮在Percoll层与水层中间,质量较大的细胞核碎片会沉于Percoll层底部;Percoll密度为30%时,完整的叶绿体可沉入Percoll层底部,质量较轻的细胞核碎片及部分线粒体会漂浮在水层中。两种浓度相结合,可以较好的将叶绿体、线粒体和细胞核碎片分开,纯度最好。利用本试验的优化方案得到了纯度较高的大葱、洋葱、大蒜、韭菜cpDNA。(3)本研究对四种葱蒜类蔬菜作物叶绿体DNA进行高通量测序,获得了大葱、大蒜、洋葱、韭菜叶绿体基因组序列,大小分别为153109bp、153189bp、153586bp、154057bp,GC含量的百分比分别为36.9%、36.7%、36.9%、36.9%,具有4个明显的叶绿体结构特征,其长度分别为大葱LSC 82206bp,SSC 17906bp,IRA 26498bp,IRB 26498bp;大蒜LSC 82024bp,SSC 17906bp,IRA26498bp,IRB26498bp;洋葱LSC 82731bp,SSC 17932bp,IRA26461bp,IRB26461bp;韭菜LSC 83081bp,SSC 17959bp,IRA26508bp,IRB26508bp。通过基因注释及系统进化分析,葱蒜类蔬菜叶绿体基因组中含有112个功能基因,但是infA基因在韭菜中丢失;韭菜从他们共同的祖先中起源最早,随后大蒜成为一个独立的分支,大葱与洋葱在起源时间相近,具有较近的亲缘关系,他们的自举置信水平均为100%。本研究对四种主要葱蒜类蔬菜作物叶绿体DNA的提取方法进行优化,并获得其叶绿体基因组序列,填补了大葱、韭菜叶绿体基因组序列的空白,为日后的深入研究奠定了良好的基础。
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