第一部分CircWWC3的筛选和验证以及转录因子ZEB1对其的调控作用目的:在乳腺癌细胞中筛选转录因子ZEB1调控的circ RNA,并研究其在乳腺癌中的生物学功能。方法:1.在MDA-MB-231中转染ZEB1并用Arraystar circ RNA芯片技术筛选差异表达的circ RNA。2.采用RT-PCR检测两个环状RNA在乳腺癌组织和细胞中的表达。RNase R和放线菌素D实验验证其在乳腺癌细胞中的特性。3.q RT-PCR检测hsa_circ₀001910和hsa_circ₀089866在乳腺癌细胞和组织中的表达情况。4.Sanger测序鉴定circWWC3的环化剪接点序列,FISH实验验证circWWC3在细胞中的主要存在部位。5.采用Ch IP-PCR和双荧光素酶报告基因实验验证ZEB1与WWC3启动子的直接结合能力。6.采用CCK-8实验、平板克隆形成实验、划痕愈合实验以及Transwell实验检测敲低circWWC3对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果:1.筛选出两个来源于WWC3基因的circ RNA,hsa_circ₀001910和hsa_circ₀009866用于后续研究。2.RT-PCR结果显示,以乳腺癌组织和细胞的c DNA和g DNA为模板,环状转录本只能通过发散引物在c DNA中扩增出来,而线性转录本可通过聚合引物同时在c DNA和g DNA中扩增出来。RNase R和放线菌素D实验结果显示,hsa_circ₀001910和hsa_circ₀009866比其相应的线性转录本更能耐受RNase R的消化作用,加放线菌素D后,环状RNA更稳定,半衰期时间更长。3.q RT-PCR显示在乳腺癌细胞和组织中hsa_circ₀001910含量明显高于hsa_circ₀009866。故选择hsa_circ₀001910用于后续研究,称为circWWC3。4.PCR产物的Sanger测序结果验证了circWWC3的环化剪接点序列。FISH实验证实circWWC3主要存在于细胞质。5.Ch IP-PCR和双荧光素酶报告基因实验证实ZEB1与WWC3启动子直接结合来影响circWWC3的表达（P<0.05）。6.CCK-8实验和平板克隆形成实验结果显示,敲低circWWC3可抑制乳腺癌细胞的增殖能力（P<0.05）。划痕愈合实验和Transwell实验结果显示,敲低circWWC3可抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力（P<0.05）。小结:MDA-MB-231细胞中转染ZEB1后,通过circ RNA芯片筛选出circWWC3为研究目标。ZEB1通过与WWC3启动子直接结合来调控circWWC3表达。CircWWC3高表达与临床分期成正相关,生存分析显示,circWWC3的表达升高代表着乳腺癌患者的总体生存能力较差。circWWC3能够促进乳腺癌细胞增殖,迁移和侵袭能力。第二部分CircWWC3通过调控PD-L1表达影响肿瘤免疫的机制研究目的:探讨circWWC3通过作为miRNA的分子海绵调控其下游免疫相关通路的可能机制。方法:1.通过Miranda和Targetscan在线数据库预测可能与circWWC3相互作用的miRNA分子及其结合位点。2.q RT-PCR和FISH实验验证circWWC3,miR-26b-3p和miR-660-3p在乳腺癌细胞中的存在部位。3.采用RIP实验和双荧光素酶报告基因实验验证circWWC3是否能与miR-26b-3p和miR-660-3p相互作用。4.采用CCK-8实验、平板克隆形成实验、划痕愈合实验以及Transwell实验检测过表达或敲低miR-26b-3p和miR-660-3p对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。5.通过挽救实验检测敲低circWWC3和miR-26b-3p和miR-660-3p对乳腺癌细胞增殖,迁移和侵袭能力的影响。6.采用q RT-PCR寻找下游免疫相关基因。7.通过Targetscan数据库预测STAT3作为下游靶基因,并用双荧光素酶报告基因实验验证。8.采用q RT-PCR和Western blot实验在乳腺癌细胞中敲低circWWC3和过表达miR-26b-3p和miR-660-3p后检测STAT3,p-STAT3,PD-L1的表达。结果:1.通过分析Miranda和Targetscan数据库,根据circWWC3序列中推定的结合位点的位置,排名前2位的miRNA是miR-26b-3p和miR-660-3p。2.q RT-PCR和FISH结果表明,circWWC3和miR-26b-3p或miR-660-3p都主要位于细胞质中。3.RIP实验和双荧光素酶报告基因实验结果显示,circWWC3在乳腺癌细胞中能与miR-26b-3p和miR-660-3p相互作用（P<0.05）。4.CCK-8实验和平板克隆形成实验结果显示,过表达miR-26b-3p和miR-660-3p可抑制MDA-MB-453细胞的增殖能力（P<0.05）;而敲低miR-26b-3p和miR-660-3p可增强MDA-MB-231和BT-549细胞的增殖能力（P<0.05）。划痕愈合实验和Transwell实验结果显示,过表达miR-26b-3p和miR-660-3p可抑制MDA-MB-453细胞的迁移和侵袭能力（P<0.05）;而敲低miR-876-5p可增强MDA-MB-231和BT-549细胞的迁移和侵袭能力（P<0.05）。5.挽救实验结果显示,circWWC3敲低可抑制增殖,迁移和侵袭,而miR-26b-3p和miR-660-3p敲低可挽救circWWC3敲低介导的细胞增殖,迁移和侵袭的抑制作用（P<0.05）。6.q RT-PCR结果显示,敲低circWWC3,过表达miR-26b-3p和miR-660-3p后PD-L1均降低（P<0.05）。7.Targetscan数据库显示miR-26b-3p和miR-660-3p均与STAT3有直接结合位点,并用双荧光素酶报告基因实验验证（P<0.05）。8.q RT-PCR显示过表达miR-26b-3p和miR-660-3p后,STAT3 m RNA没有变化。Western blot实验显示敲低circWWC3和过表达miR-26b-3p和miR-660-3p后STAT3,p-STAT3,PD-L1表达均降低（P<0.05）。小结:CircWWC3与miR-26b-3p和miR-660-3p有直接结合位点,miR-26b-3p和miR-660-3p均能抑制乳腺癌增殖,迁移和侵袭。STAT3是miR-26b-3p和miR-660-3p的下游靶基因。circWWC3通过与两个miRNA海绵状结合,从而激活STAT3使其作用于PD-L1发挥免疫逃逸作用。第三部分ZEB1通过在体内调节circWWC3促进乳腺癌的生长和转移目的:体内验证ZEB1通过调控circWWC3对乳腺癌的影响。方法:将雌性裸鼠随机分为4组,每组5只,MDA-MB-231-luc cells分别转染（1）Empty vector+sh-scramble（2）ZEB1+sh-scramble（3）Empty vector+sh-circWWC3（4）ZEB1+sh-circWWC3,皮下或通过尾静脉注射入小鼠。每周使用体内成像系统（IVIS）评估肿瘤。结果:1.对于裸鼠移植瘤模型,ZEB1过表达能够加快乳腺癌增殖,而shRNA介导的circWWC3的敲低逆转了ZEB1诱导的乳腺癌生长（P<0.05）。2.对于转移模型,ZEB1过表达后肺部和肝部转移灶明显增多,而ZEB1和sh-circWWC3共转染组转移灶数量减少,说明ZEB1的过表达增加了乳腺癌的转移,而sh RNA介导的circWWC3的敲低部分逆转了ZEB1诱导的乳腺癌的转移（P<0.05）。3.生存分析显示ZEB1和circWWC3的高表达表明乳腺癌患者的预后生存较差（P<0.05）。小结:ZEB1过表达可以促进乳腺癌肿瘤的增长和转移,而sh RNA介导的circWWC3的敲低部分逆转了ZEB1诱导的乳腺癌肿瘤的增长和转移。结论:我们的研究可以得出以下主要结论:（1）我们鉴定了由ZEB1诱导并促进乳腺癌生长和转移的新型环状RNA circWWC3;（2）我们发现circWWC3可以充当miR-26b-3p和miR-660-3p的海绵,并抑制它们在乳腺癌中的功能;（3）miR-26b-3p和miR-660-3p在乳腺癌中起到抑癌作用;（4）我们证明circWWC3通过海绵miR-26b-3p和miR-660-3p,激活miR-26b-3p和miR-660-3p的直接靶标STAT3,STAT3的激活能够影响PD-L1发挥免疫逃逸功能。