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【研究目的】本论文研究目的如下:(1)合成并制备新型脂质功能化阳离子类肽脂质纳米微球(LNP,lipid nanoparticles);(2)评价其肿瘤靶向递送siRNA效率。通过测试其体外转染效率,确定阳离子类肽的氨基酸排列模式,通过以上观察制备具有生物相容性的脂质纳米微球。此外,比较新型脂质分子的siRNA递送效率,进一步评价肿瘤靶向siRNA的递送效率,即以STAT3作为靶点的免疫检查点分子阻抑导致的RNAi介导的肿瘤抑制效果。【研究方法】一、新型脂质纳米颗粒的制备及体外研究:(1)制备方法:首先,我们合成了含有直线型和分支型的鸟氨酸三肽的胆固醇功能化阳离子脂质(Chorn3)。接下来,我们制备了含有Chorn3、DOPC和PEG2000-C-DMA的脂质纳米微球,并通过凝胶电泳、Zeta电位、粒径分布和TEM对其进行了表征。进一步通过MTT法以及转染FITC-siRNA、质粒(pcDNA-eGFP)对脂质纳米微球的体外转染效率进行了测定。(2)体外转染效率评估:我们系统比较了8种油酸作为脂质基团的Dogo,并制备了由Dogo4和Chorn3协同组成的脂质纳米微球(命名为DoCh)并进行了表征;进一步测量了体外siRNA递送效率,包括FITC-siRNA在细胞中的分布,以及B16F10黑色素瘤细胞中siSTAT3的递送。二、DoCh介导的肿瘤靶向siRNA递送:建立小鼠B16F10黑色素瘤模型,分别递送FITC-siRNA/DoCh混合物及裸露的FITC-siRNA,观察并测量肿瘤组织及主要脏器中的荧光分布并测定荧光强度。在体内实验中,将B16F10-GFP模型小鼠分为未处理组、siControl/DoCh、siSTAT3/DoCh及ADR组。从尾静脉注射开始记录未处理组及所有治疗组小鼠的肿瘤大小、小鼠体重,并通过活体成像观察肿瘤增值情况。随后计算肿瘤抑制率,并对靶标基因(STAT3)及免疫检查点基因(PD-L1)的mRNA和蛋白表达进行测定。最后记录小鼠的存活率至第40天。【研究结果】一、基于Chorn3的LNP:胆固醇功能化类肽Chorn3脂质的产率为89.8%。由Chorn3、DOPC和PEG2000-C-DMA组成的配方形成了稳定、均匀且具有生物相容性的LNP,直径为150 nm。以Chorn3为基础的LNP有效地将质粒DNA转移到细胞中,诱导GFP基因表达,其中以配方5:1:0.1(Chorn3:DOPC:PEG-2000-C-DMA摩尔比)转染效率最高。二、基于Dogo的LNP:基于Dogo的8个脂质分子的转染效率显示,Dogo4转染效率最高,毒性最低。由Dogo4和Chorn3(命名DoCh)协同制备的LNP颗粒均匀,siRNA结合能力最强,细胞毒性可忽略。B16F10肿瘤细胞中由DoCh(4:1:0.1)介导的体外RNAi作用使STAT3基因表达降低了90%。注射裸FITC-siRNA在肿瘤组织中无信号,注射FITC-siRNA/DoCh LNP复合物在肿瘤组织中显示强烈的荧光信号。FITC-siRNA也在肝脏、肺中有积累。未处理组和siSTAT3/DoCh组的体重分别下降了52%和13%(p<0.05),而ADR组下降了5%,可能是由于ADR毒性导致的。siSTAT3/DoCh和ADR组肿瘤增殖有明显差异,表明是由DoCh介导的siSTAT3递送引起的。siSTAT3/DoCh组肿瘤抑制率为56.1%,小于ADR组。当未处理组和siCtrl/DoCh组小鼠全部死亡时,siSTAT3/DoCh组还剩50%。siSTAT3/DoCh治疗组STAT3 mRNA表达下降90%,PD-L1 mRNA和蛋白表达均受到强烈抑制。血清中肝酶含量分析显示DoCh介导的siRNA递送不引起肝毒性,血清中ALT/AST水平没有升高(p<0.001)。【研究结论】Chorn3具有良好的生物相容性和体外核酸递送效率。然而,基于Chorn3的LNP在体内递送siRNA的效率较低。由Chorn3和Dogo4协同组成的LNP(DoCh LNP)具有显著的肿瘤靶向效率和生物相容性。DoCh载体有效地将siRNA递送至B16F10肿瘤小鼠模型,诱导RNA干扰,抑制肿瘤生长。DoCh LNP是一种很有前途的肿瘤靶向siRNA药物递送体系。