论文部分内容阅读
CRISPR/Cas9是目前炙手可热的基因组编辑技术,已广泛应用于干细胞生物学、基因组学、发育生物学和癌症研究等前沿领域。在向导RNA(guide RNA,gRNA)的引导下,Cas9蛋白可以结合在基因组上与gRNA互补配对的靶位点,通过Cas9的核酸酶活性切割基因组形成双链断裂(double-strands break,DSB)。细胞会利用易错的非同源末端连接(non-homologous end-joining,NHEJ)或精确的同源重组(homology-directed repair,HDR)对断裂位点进行修复。NHEJ可能导致序列移码,破坏目的基因功能;HDR可以设计同源DNA模版,将供体DNA序列准确整合进入基因组。因此,研究人员利用CRISPR/Cas9系统可以轻松实现目的基因的敲除与敲入,从而深入研究基因功能,解析生命活动现象。传统的CRISPR/Cas9系统尽管功能强大,但其依赖DSB的基因组编辑方还式存在诸多缺陷。Cas9蛋白编辑基因的关键在于细胞对DSB的修复途径,NHEJ的修复方式主要用于基因敲除,其随机性强,插入或删除的碱基数难以控制,有时无法对目的基因产生敲除效果;HDR的修复方式十分精确,能对基因组序列进行可控编辑,但效率较低,难以实现。同时,Cas9蛋白所引起的DSB对基因组也是一种损害。当同时打靶基因组多个位点时,Cas9的过度切割可能会引起染色体片段删除、易位等结构变异和染色体消除,损害超出细胞的承受范围时甚至会导致细胞死亡。为解决上述问题,许多科学家致力于研究新的技术体系,在不依赖DSB的情况下实现安全高效的基因组编辑。2016年,David R.Liu研究团队基于CRISPR/Cas9系统,通过融合胞嘧啶脱氨酶(APOBEC1)与尿嘧啶糖基酶抑制因子(UGI),开发出了碱基编辑系统BE(base editor),该系统能将靶位点C:G碱基对替换为T:A碱基对,同时并不引起DSB,避开了DSB带来的一系列负面影响。在随后不超过一年的时间里,又相继出现了Target-AID,TAM,CRISPR-X三种与BE系统类似的碱基编辑系统。碱基编辑系统一经开发便引起了广泛关注,研究人员迅速将其应用于哺乳动物细胞,水稻,小鼠,斑马鱼等模式物种中,挖掘其在基因治疗研究,药物高通量筛选,作物遗传改良,以及动物模型构建中的应用潜力,但目前尚未见任何关于碱基编辑系统成功在无脊椎动物中应用的报道。家蚕作为鳞翅目昆虫的代表,是典型的无脊椎动物,早在2004年就已完成了基因组测序,以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑工具也已在家蚕中成功应用,为家蚕功能基因组学研究提供了有力的技术支撑。基因编辑技术的发展日新月异,实现前沿技术——碱基编辑系统——在家蚕中的成功应用将进一步助力家蚕基因功能研究,同时也能为其他难以实现Cas9介导同源重组的物种提供参考范例。为此,我们开展了BE3在家蚕中的应用研究,结果表明,BE3同样能介导家蚕基因组特定位点C:G碱基对到T:A碱基对的替换,编辑效率最高达到66.2%;利用BE3还可以实现外源与内源基因的高效敲除;针对EGFP基因,BE3能实现最多14个碱基的同时编辑,并且几乎不引入indel。以下为具体研究结果:1.建立家蚕BE3碱基编辑系统通过将家蚕密码子优化的BE3表达载体与gRNA表达载体共转至家蚕细胞中,检测发现BE3成功介导家蚕基因组碱基编辑,将靶位点C:G碱基对替换为T:A碱基对,gRNA-Blos2和gRNA-Yellow-e的编辑效率分别为40%和51.2%。另外,在gRNA-Yellow-e的引导下,BE3最多能同时编辑4个碱基。2.全面研究BE3在家蚕中的编辑范围通过设计覆盖C1-C20(以NGG标号为21,22,23排序)的32个gRNA序列,检测发现BE3(可以介导C1-C13范围中的C:G碱基对突变为T:A碱基对。BE3在家蚕的编辑范围(C1-C13)相比植物(C3-C9)与哺乳动物细胞(C4-C8)更广,而更大的编辑范围意味着更多的打靶位点与更多的突变可能性,有利于BE3应用于家蚕功能基因研究。另外,处于编辑范围中不同位置的C:G碱基对,突变效率明显不同,效率高的位点主要集中在C4-C7。3.建立家蚕BE3敲除体系利用BE3能使C:G碱基对编辑为T:A碱基对的特点,可以将编码氨基酸的密码子(CAG/CGA/CAA/TGG)转换为终止密码子(TAG/TGA/TAA),通过引入无义突变的方式来敲除目的基因。利用这一体系,高效敲除了荧光报告基因mCherry,嘌呤霉素抗性基因Puromycin,效率最高分别为66.2%和58.3%。同时也敲除了家蚕基因BmGAPDH和BmV-ATPase B,成功验证了BE3作为家蚕内源基因敲除工具的普适性。通过生物信息学分析,在家蚕全基因组范围,共鉴定到超过150,000潜在的敲除打靶位点,覆盖家蚕96.5%的基因,平均每个基因约11个敲除靶位点,这些靶位点在基因CDS中分布均匀,覆盖范围广,既能有效提前终止蛋白翻译,实现基因敲除,又能为家蚕全基因组高通量基因功能鉴定与筛选提供技术支持。4.实现BE3同时编辑基因组上14个碱基在32个gRNA的共同作用下,BE3能同时将EGFP基因上的14个C:G碱基对替换为T:A碱基对。由于BE3在编辑基因组时并不会像Cas9那样切割基因组造成DNA双链断裂,因此几乎不引入移码突变。这为体内研究蛋白质关键氨基酸位点,定向改造基因与蛋白提供了理论基础与技术支持。