目的:邻苯二甲酸二异壬酯（di-isononyl phthalate,DINP）是一种高分子量的邻苯二甲酸酯,主要用于商业、工业和医疗产业中。由于其毒性较低,常作为邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di-（2-ethylhexyl）phthalate,DEHP）的替代品,近几年DINP的应用越来越广泛。据报道,DINP暴露可对人体内分泌系统、消化系统、神经系统、泌尿系统以及生殖系统造成损害,尤其是男性生殖系统,但DINP对女性生殖系统损伤的影响及其潜在机制仍有待研究。本课题拟通过体内实验和体外实验,探究自噬在DINP诱导小鼠卵巢颗粒细胞凋亡中的作用及其可能作用机制。方法:1.不同剂量的DINP给雌性小鼠连续灌胃14d,用HE染色检测DINP对小鼠卵巢组织的影响;用ELISA法检测小鼠血清中雌二醇水平。2.CCK-8法检测DINP对小鼠卵巢颗粒细胞（GCs）活性的影响。3.Western Blot法分别检测DINP对小鼠卵巢组织和卵巢颗粒细胞凋亡和自噬的影响;再用Annexin V-FITC/PI双染色法进一步验证DINP对细胞凋亡的影响,用透射电子显微镜进一步观察DINP对细胞自噬的影响。4.氧化应激检测试剂盒分别检测DINP对小鼠卵巢组织和卵巢颗粒细胞氧化应激的影响。5.用NAC抑制小鼠卵巢颗粒细胞氧化应激后,分别用CCK-8法、Western Blot、Annexin V-FITC/PI双染法及透射电子显微镜测定DINP对小鼠卵巢颗粒细胞活性、凋亡和自噬的影响,以探明氧化应激在DINP在诱导小鼠卵巢颗粒细胞凋亡和自噬中的作用。6.用3-MA抑制小鼠卵巢颗粒细胞自噬后,用Western Blot和Annexin VFITC/PI双染色法检测DINP对小鼠卵巢颗粒细胞活性和细胞凋亡的影响,以探明自噬在DINP诱导小鼠卵巢颗粒细胞凋亡中的作用。结果:1.不同剂量的DINP给雌性小鼠连续灌胃14d,HE染色结果显示DINP可导致小鼠卵巢组织中的颗粒细胞排列紊乱,同时ELISA结果发现DINP明显降低小鼠血清中雌二醇含量,表明DINP对小鼠卵巢颗粒细胞结构和功能具有损伤作用。2.CCK-8结果显示,DINP使卵巢颗粒细胞活性呈浓度依赖式地降低。3.Western Blot结果发现,DINP可显著上调小鼠卵巢组织和卵巢颗粒细胞中Bax、cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-8等凋亡蛋白的表达,下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,提示DINP可诱导小鼠卵巢组织和卵巢颗粒细胞均发生凋亡;同时,DINP可显著提高小鼠卵巢组织和卵巢颗粒细胞中自噬蛋白LC3-II、Beclin1和Atg 5的表达水平以及LC3-II/LC3-I的比例,提示DINP可诱导小鼠卵巢组织和卵巢颗粒细胞均产生自噬。Annexin V-FITC/PI双染色法结果发现,DINP可明显升高小鼠卵巢颗粒细胞的凋亡率,表明DINP确实可诱导小鼠卵巢颗粒细胞发生凋亡。TEM结果发现DINP可显著增加卵巢颗粒细胞内自噬泡的数量,进一步表明DINP确实可诱导小鼠卵巢颗粒细胞发生自噬。4.活性氧试剂盒的检测结果发现DINP可明显提高小鼠卵巢组织和卵巢颗粒细胞中的MDA水平,而降低其GSH水平以及SOD、GSH-PX的活性,表明DINP可诱导小鼠卵巢组织和卵巢颗粒细胞均产生氧化应激。5.用NAC抑制小鼠卵巢颗粒细胞氧化应激后,CCK-8检测结果发现,与DINP单独处理组相比,NAC+DINP联合处理组中的卵巢颗粒细胞活性明显升高;Western Blot和Annexin V-FITC/PI双染色法等实验结果也显示NAC+DINP联合处理组可显著减轻DINP对卵巢颗粒细胞凋亡的诱导作用,表明氧化应激可促进DINP诱导的卵巢颗粒细胞凋亡;同时,NAC+DINP联合处理组中卵巢颗粒细胞的自噬相关蛋白表达水平也显著降低,且TEM结果也显示NAC+DINP联合处理组中的自噬泡明显低于DINP单独处理组,表明氧化应激可促进DINP对卵巢颗粒细胞自噬的诱导作用。6.用3-MA抑制小鼠卵巢颗粒细胞自噬后,CCK-8法、Western Blot和Annexin V-FITC/PI双染色法结果显示,与DINP单独处理组相比,3-MA+DINP联合处理组可明显缓解DINP对卵巢颗粒细胞活性的抑制和对细胞凋亡的诱导,表明自噬可促进DINP对卵巢颗粒细胞凋亡的诱导作用。结论:DINP暴露可诱导小鼠卵巢组织和卵巢颗粒细胞的凋亡、自噬和氧化应激;氧化应激参与了DINP对小鼠卵巢颗粒细胞凋亡和自噬的诱导;自噬参与了DINP对小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的诱导而发挥细胞毒性作用。