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1 目的采用数据挖掘方法整理、分析类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）心功能的变化及其与免疫炎症指标的相关性、关联性,探讨健脾化湿通络法对其作用。应用临床体内实验探讨RA患者心功能参数、免疫炎症指标与细胞因子、microRNA-23a-3p/第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（microRNA-23a-3p/phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten/phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR）信号通路的相关性,探究RA心功能下降的初步机制。通过体外细胞实验,研究健脾化湿通络方-新风胶囊（Xinfeng Capsule,XFC）改善RA心功能的生物学机制。2 方法2.1 数据挖掘研究研究安徽中医药大学第一附属医院风湿科2016年9月-2020年07月RA住院患者病历资料。观察RA患者心功能参数的变化及与免疫炎症指标的相关性、关联性,二元Logistics回归分析RA心功能下降的危险因素。通过复杂网络图分析RA心功能变化患者核心处方,统计中药性味归经频数,采用关联规则探究中医药对RA心功能变化患者免疫炎症指标、心功能参数的影响。2.2体内实验研究选取30例RA心功能下降患者为研究组（RA组）,30例正常健康人为对照组（HCs组）,分析两组心功能参数、免疫炎症指标的变化,采用实时荧光定量（real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR）检测 miR-23a-3p、PTEN、PI3K、AKT、mTOR 的表达,ELISA 法（enzyme-linked immunosorbent method）检测白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α的变化。分析RA心功能下降患者心功能参数、免疫炎症指标与miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路、细胞因子的相关性。2.3 体外实验研究2.3.1 XFC含药血清对RA-CD4+T细胞联合RA-FLS共培养中miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响从正常人与RA患者外周血中分离出CD4+T细胞,并利用transwell小室与RA滑膜成纤维细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）进行共培养,分为7组,control-1组:RA-FLS;control-2组:正常CD4+T和RA-FLS 共培养;model组:RA-CD4+T和RA-FLS共培养;XFC组:model+XFC（最佳浓度）含药血清;mimics-NC组:model+mimics-miR-23a-3p-NC;mimics组:model+mimics-miR-23a-3p;mimics+XFC组:model+mimics-miR-23a-3p+XFC（最佳浓度）含药血清。采用 RT-qPCR 法检测下室细胞中 miR-23a-3p、PTEN、PI3K、AKT、mTOR的表达。采用ELISA法检测上清液中细胞因子的表达。采用蛋白免疫印迹法（Western blotting,WB）检测下室细胞中 PTEN、PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白的表达。采用SPSS 21.0统计软件分析数据。2.3.2 XFC含药血清对RA-CD4+T细胞联合人正常心肌细胞共培养中miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响从正常人与RA患者外周血中分离出CD4+T细胞,并利用transwell小室与正常人心肌细胞（Human Cardiac Myocyte,HCM）进行共培养,分为7组,control-1 组:HCM;control-2 组:正常 CD4+T 细胞和 HCM 共培养;model 组:RA-CD4+T细胞和HCM共培养;XFC组:model+XFC（最佳浓度）含药血清;mimics-NC 组:model+mimics-miR-23a-3p-NC;mimics 组:model+mimics-miR-23a-3p;mimics+XFC 组:model+mimics-miR-23a-3p+XFC（最佳浓度）含药血清。用 RT-qPCR 法检测下室细胞中 miR-23a-3p、PTEN、PI3K、AKT、mTOR 的表达。采用ELISA法检测上清液中细胞因子表达。采用WB法检测下室细胞中PTEN、PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白的表达。采用免疫荧光法（Immunofluorescence,IF）检测下室细胞中脑利钠肽（brain natriuretic peptide,BNP）、连接蛋白-43（Connexin-43,Cx43）、心肌肌钙蛋白 I（Cardiac Troponin I,cTnI）、心肌肌钙蛋白T（cTnT）的表达。采用SPSS 21.0统计软件分析数据。3 结果3.1 数据挖掘研究结果3.1.1 RA心功能参数的变化及与免疫炎症指标相关性分析在1596例患者中,心功能参数变化的例数共有1011例,占63.35%,其中,每搏输出量（stroke volume,SV）下降的例数最多为611例,占38.28%。相关性分析显示,右心室流出道内径（right ventricular outflowtract diameter,RVOTd）、主动脉内径（aorta diameter,AODd）、左心房内径（left atrium diameter,LADs）、SV与补体C3（Complement3,C3）呈正相关,左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter,LVDd）与C3呈负相关（P<0.05）;AODd、LADs、右心室舒张末期内径（right ventricular end-diastolic diameter,RVDd）与超敏-C 反应蛋白（Hypersensitive c-reactive protein,hs-CRP）呈正相关,射血分数（ejection fraction,EF）、缩短分数（fractional shortening,FS）与 hs-CRP、抗环瓜氨酸肽抗体（Anti cyclic citrullinated peptide antibody,anti-CCP）呈负相关（P<0.05）;LVDd 与补体 C4（C4）呈正相关（P<0.05）。3.1.2 RA患者心功能参数与免疫炎症指标关联分析关联规则发现AODd升高、SV降低与anti-CCP、血沉（Erythrocyte sedimentation rate,ESR）、hs-CRP、类风湿因子（Rheumatoid factor,RF）的升高有强关联,最小支持度为20%,最小置信度为85%。3.1.3 RA患者心功能参数与免疫炎症指标的二元Logistics回归分析结果发现C3、ESR、免疫球蛋白M（Immunoglobulin M,IgM）、RF的升高是RA心功能降低的危险因素。3.1.4 RA心功能变化患者中药使用情况在4622张处方314味中药中,使用频率前20名的药物为:a)活血化瘀药:红花、丹参、桃仁、鸡血藤、川芎、当归;（b）健脾化湿药:茯苓、薏苡仁、泽泻、麦芽、陈皮、姜半夏、甘草、山药;（c）祛风除湿药:豨签草、威灵仙、忍冬藤、徐长卿;（d）清热解毒药:蒲公英、白花蛇舌草。寒、温药性,甘、苦、辛药味,肝、肺、脾、胃、肾、心经的中药出现频率及使用频率较高。常用药对为健脾化湿药（陈皮、薏苡仁、茯苓）与活血化瘀药（红花、丹参）、清热解毒药（蒲公英）。3.1.5 RA心功能变化患者中药与免疫炎症指标的关联分析蒲公英、薏苡仁、茯苓、红花与hs-CRP下降关联度高,蒲公英、陈皮、茯苓与C4下降关联度高,薏苡仁、红花、蒲公英、茯苓与ESR下降关联度高。红花配伍桃仁、蒲公英、陈皮、薏苡仁、茯苓、丹参与hs-CRP下降关联度较高,茯苓配伍薏苡仁、陈皮与hs-CRP下降关联度较高,蒲公英配伍薏苡仁与hs-CRP下降关联度较高,红花配伍茯苓、陈皮与ESR下降关联度较高,陈皮配伍茯苓与C4下降关联度较高。3.1.6 RA心功能变化患者中药与心功能参数的关联分析桃仁、茯苓、山药、甘草、红花、丹参、陈皮与SV升高关联度高,丹参、陈皮与AODd下降关联度高,丹参、红花与FS升高关联度高,茯苓与RVDd下降关联度高,红花与EF升高关联度高。红花配伍茯苓、桃仁、丹参、陈皮及茯苓配伍陈皮、丹参与SV关联度高。3.1.7 XFC联合中药与免疫炎症指标及心功能参数关联分析XFC联合薏苡仁与hs-CRP下降关联度高,XFC联合豨签草、蒲公英与ESR下降关联度高,XFC联合陈皮、蒲公英与C3下降关联度高,XFC联合桃仁、威灵仙、茯苓、陈皮、红花、薏苡仁、蒲公英、丹参与RF下降关联度高。XFC联合红花与RVOTd、AODd下降关联度高。3.2体内实验研究3.2.1一般情况RA组中男4例,女26例,年龄为58.2（45-72）岁,病程11.5（0.5-35）年;HCs组中男7例,女23例,年龄为57.0（45-70）岁。两组在年龄、性别等方面比较无差异（P>0.05）。3.2.2两组免疫炎症指标、心功能参数的比较与HCs组相比,RA组hs-CRP、ESR、RF、anti-CCP水平显著升高（P<0.05）;RA 组 EF、SV、FS 显著降低（P<0.05）。3.2.3 两组 miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR 通路相关指标比较与HCs组相比,RA组miR-23a、PI3K、AKT、mTOR表达水平显著升高,PTEN表达水平显著下降（P<0.05）。3.2.4两组细胞因子比较与HCs组相比,RA组IL-1β、IL-6、TNF-α表达上调,而IL-10表达下调（P<0.05）。3.2.5 RA心功能下降患者免疫炎症指标与miR-23a-3p/PTEN/PI3K/Akt/mTOR通路、细胞因子的相关性分析miR-23a-3p、IL-6 与 ESR 呈正相关,PTEN、IL-10 与 ESR 呈负相关（P<0.05）;miR-23a-3p、PI3K、TNF-α、IL-1β 与 hs-CRP、RF 呈正相关,PTEN、IL-10 与 hs-CRP、RF 呈负相关（P<0.05）。3.2.6 RA心功能下降患者心功能参数与miR-23a-3p/PTEN/PI3K/Akt/mTOR通路、细胞因子的相关性分析miR-23a-3p 与 RVOTd、LADs、RVDd、SV 呈正相关,PTEN 与 RVOTd、LADs、RVDd、SV呈负相关,PI3K与RVOTd呈正相关,AKT与LVDd呈正相关（P<0.05）;TNF-α、IL-1β 与 RVOTd、LADs、RVDd、LVDd、AODd、SV呈正相关,IL-6 与 RVOTd、LADs、AODd 呈正相关,IL-10 与 RVOTd、RVDd、SV呈负相关（P<0.05）。3.3 体外实验研究3.3.1 XFC 含药血清对 RA-CD4+T 细胞联合 RA-FLS 共培养 miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响3.3.1.1 CCK-8检测XFC含药血清对RA-CD4+T细胞联合RA-FLS共培养的抑制作用细胞抑制率随时间及浓度的增加逐渐的增强。10%XFC含药血清在作用48h对细胞的抑制率接近50%。故10%XFC含药血清为最佳作用浓度,48h为最佳作用时间。3.3.1.2 RT-qPCR 检测各组 miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR 的表达水平相较于 control-1、control-2 组,model 组中 miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR表达上调,PTEN表达下调（P<0.05）;而相较于model组,XFC组miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR 表达下调,而 PTEN 表达上调（P<0.05）。与mimics-NC 组相比,mimics 组中 miR-23a-3p 表达上调,PI3K、AKT、mTOR 表达上调,PTEN表达下调（P<0.05）。相较于mimics组,mimics+XFC组中miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR 表达下调,PTEN 表达上调（P<0.05）。3.3.1.3 ELISA检测各组细胞因子的表达水平相较于 control-1、control-2 组,model 组中 IL-1β、IL-6、TNF-α 表达上调,IL-10 表达下调（P<0.05）;而相较于 model 组,XFC 组 IL-1β、IL-6、TNF-α 表达下调,IL-10表达上调（P<0.05）。与mimics-NC组相比,mimics组中IL-1β、TNF-α表达上调,IL-10表达下调（P<0.05）。相较于mimics组,mimics+XFC 组中 IL-1β、IL-6、TNF-α 表达下调,IL-10 表达上调（P<0.05）。3.3.1.4 WB检测各组PTEN/PI3K/AKT/mTOR蛋白的表达水平相较于 control-1、control-2 组,model 组中 PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达上调,PTEN表达下调（P<0.05）;而相较于model组,XFC组PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR 表达下调,而 PTEN 表达上调（P<0.05）。与 mimics-NC 组相比,mimics 组中 PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达上调,PTEN表达下调（P<0.05）。相较于mimics组,mimics+XFC 组中 PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR 表达下调,PTEN 表达上调（P<0.05）。3.3.2 XFC含药血清对RA-CD4+T细胞联合HCM共培养中miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响3.3.2.1 CCK-8检测XFC含药血清对RA-CD4+T细胞联合HCM共培养的抑制作用随着药物浓度的增加,细胞抑制率逐渐增强;10%XFC含药血清在作用48h对细胞的抑制率接近50%。故10%XFC含药血清为最佳作用浓度,48h为最佳作用时间。3.3.2.2 RT-qPCR 检测各组 miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR 的表达水平相较于 control-1、control-2组,model 组中 miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR表达上调（P<0.01）,PTEN表达下调（P<0.05）;而相较于model组,XFC 组 miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR 表达下调,而 PTEN 表达上调（P<0.01）。与mimics-NC 组相比,mimics 组中 miR-23a-3p 表达上调,PI3K、AKT、mTOR表达上调,PTEN表达下调（P<0.01）。相较于mimics组,mimics+XFC 组中 miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR 表达下调,PTEN 表达上调（P<0.01）。3.3.2.3 ELISA检测各组细胞因子的表达水平相较于 control-1、control-2 组,model 组中 IL-1β、IL-6、TNF-α 表达上调,IL-10 表达下调（P<0.01）;而相较于 model 组,XFC 组 IL-1β、IL-6、TNF-α 表达下调,IL-10表达上调（P<0.01）。与mimics-NC组相比,mimics组中IL-lβ、TNF-α表达上调,IL-10表达下调（P<0.01）。相较于mimics组,mimics+XFC 组中IL-lβ、IL-6、TNF-α 表达下调,IL-10 表达上调（P<0.01）。3.3.2.4 WB检测各组PTEN/PI3K/AKT/mTOR蛋白的表达水平相较于 control-1、control-2 组,model 组中 PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达上调,PTEN表达下调（P<0.01）;而相较于model组,XFC组PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR 表达下调,而 PTEN 表达上调（P<0.01）。与 mimics-NC 组相比,mimics 组中 PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达也明显上调（P<0.01）,PTEN表达下调（P<0.05）。相较于 mimics 组,mimics+XFC 组中 PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR 表达下调,PTEN表达上调（P<0.01）。3.3.2.5 IF检测各组心肌细胞标志物表达的影响与 control-1、control-2 相比,model 组 BNP、Cx43、cTnI、cTnT 阳性表达显著增加（P<0.05）;与model组相比,XFC组BNP、Cx43、cTnI、cTnT表达降低（P<0.05）;与 mimics-NC 组相比,mimics组BNP、Cx43、cTnI、cTnT阳性表达显著增加（P<0.05）;与mimics组相比,mimics+XFC组BNP、Cx43、cTnI、cTnT 表达降低（P<0.05）。4 结论4.1 有63.35%的RA患者心功能参数异常,以SV下降为主;且其与免疫炎症指标有强关联,我院风湿科治疗RA心功能异常以主要有以下4类药物:健脾化湿药、清热解毒药、活血化瘀药、祛风湿通络药,以健脾化湿药为核心。健脾化湿药的使用与患者免疫炎症指标、心功能参数的改善有强关联,且中药联合XFC后改善作用更明显。4.2 RA心功能下降患者miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路异常活化,细胞因子表达失衡,且心功能参数、免疫炎症指标与miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路、细胞因子明显相关。4.3 XFC能够改善RA患者心功能,其作用机制包括:XFC通过下调miR-23a-3p,上调PTEN,抑制PI3K/AKT/mTOR活化,进一步下调促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达,上调抑炎因子IL-10的表达,降低BNP、Cx43、cTnI、cTnT的表达,改善患者免疫炎症反应,从而改善RA患者心功能。