【研究背景及目的】肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）（以下简称肝癌）是世界上最常见的恶性肿瘤之一。近年来，尽管肝癌的诊断与治疗已取得许多进展，但由于其起病隐匿，病人确诊时往往已失去接受手术切除或肝移植等根治性治疗的机会，因此肝癌的预后仍不容乐观，亟需寻找新的治疗策略与靶点。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类发挥转录后调控效应的内源性单链非编码RNA。miRNA可通过影响癌基因或抑癌基因的相关通路在肿瘤的发生发展过程中起到重要作用，近年来它已成为包括肝癌在内的肿瘤研究领域的热点。miR-370位于人14号染色体及同源的小鼠12号染色体上的Dlk1/DIO3印记基因区。该印记基因区含有基因组中最大的一簇miRNA，其中包括miR-370在内的许多miRNA被证实与多种肿瘤的发生发展密切相关。既往研究表明miR-370在血液系统肿瘤、消化系统肿瘤、头颈部肿瘤、神经系统肿瘤、泌尿和生殖系统肿瘤中均发挥重要作用，但关于其在肿瘤中发挥促进作用还是抑制作用目前存在争议，甚至在同一种肿瘤，如白血病和胃癌中miR-370的作用还存在相反的报道。关于miR-370生理功能的研究主要集中于它对肝脏脂肪代谢的调控上。有报道显示miR-370可通过促进肝脏特异miRNA miR-122的表达或直接调控肉碱棕榈酰基转移酶（Cpt1α）影响肝细胞脂肪代谢，提示miR-370对肝细胞正常功能维持具有重要作用。新近亦有研究表明miR-370在缺血再灌注损伤的小鼠模型肝组织中表达上调，通过尾静脉注射miR-370的抑制剂可减轻小鼠的缺血再灌注损伤。以上结果提示作为肿瘤相关的重要miRNA，miR-370亦在肝脏的生理和病理过程中扮演重要角色。但关于miR-370在肝癌中的作用目前尚未见报道。本课题将全面探讨miR-370在体内外对肝癌细胞恶性生物学行为的作用，并通过寻找下游靶基因和相关的信号转导通路深入探讨其作用机制，为肝癌的临床治疗提供新的靶点与思路。【实验方法】一、miR-370对肝癌细胞恶性生物学行为的作用1. miR-370对肝癌细胞株凋亡的影响利用化学合成的miR-370寡核苷酸类似物（miR-370mimic）转染肝癌细胞株，上调其中miR-370的表达，转染后细胞培养于含有10%胎牛血清（fetal calf serum，FBS）的DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle’s medium，DMEM）培养基中；或利用2′-甲氧修饰的与miR-370序列互补的寡核苷酸（miR-370inhibitor）抑制肝癌细胞中miR-370的作用，此时细胞培养于不含FBS的DMEM培养基中。进行以上转染96小时后利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，评价miR-370对肝癌细胞株凋亡的影响。2. miR-370在体外对肝癌细胞株迁移和侵袭能力的影响利用miR-370mimic上调肝癌细胞株中miR-370的表达，或利用miR-370inhibitor抑制miR-370的作用，通过transwell实验观察细胞迁移和侵袭能力的改变。3.抑制miR-370作用对正常肝细胞株迁移和侵袭能力的影响利用miR-370inhibitor抑制永生化人正常肝细胞株（human nontransformedimmortalized hepatocytes, IMH）中miR-370作用，通过transwell实验观察细胞迁移和侵袭能力的改变。4. miR-370对肝癌细胞株在小鼠皮下成瘤能力的影响将感染可高效表达miR-370的重组复制缺陷型腺病毒Ad-miR-370和对照病毒Ad-GFP的肝癌细胞株MHCC-97H（4×106细胞/100μl）或YY-8103（2×106细胞/100μl）重悬于不含FBS的DMEM培养基中，将两组细胞悬液分别注射于同一裸鼠双侧皮下（100μl/侧）（n=8），定期观察比较两侧肿瘤大小，观察40天后处死小鼠，比较两侧肿瘤体积和重量的差别，并利用Real-time PCR检测肿瘤组织中miR-370的表达。5. miR-370对肝癌细胞体内转移能力的影响用腺病毒Ad-miR-370和对照病毒Ad-GFP感染已标记荧光素酶的肝癌细胞MHCC-LM3，经尾静脉注射入NOD/SCID小鼠体内（1.5×106/只）。利用活体成像仪监测在体荧光信号，每周一次。8周后处死小鼠，将肺取出后用活体成像仪检测荧光信号值，分别观察各组小鼠肺的大体变化，计数肺表面结节个数，HE染色观察病理变化。6.瘤内注射miR-370腺病毒对小鼠皮下种植瘤模型的作用将MHCC-97H细胞（4×106）种植于裸鼠双侧皮下，待肿瘤可见时，双侧肿瘤内分别注射腺病毒Ad-miR-370和对照病毒Ad-GFP，每次注射2×109空斑形成单位（plaque-forming units，pfu）的病毒，每周2次，共注射3周，最后一次注射4天后处死小鼠，观察并比较两侧肿瘤大小，留取肿瘤标本，利用HE染色观察病理变化，免疫组织化学法检测增殖相关指标Ki-67表达，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法（terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick endlabeling，TUNEL）检测凋亡情况，Real time PCR法检测miR-370表达。二、miR-370与靶基因LIN28A的相互作用（一）miR-370对LIN28A的调控作用1.通过软件Target Scan和Pic Tar预测miR-370的潜在靶基因；用Real-time PCR和Western Blot方法检测肝癌细胞株转染miR-370mimic上调miR-370表达或转染miR-370inhibitor抑制miR-370作用后其潜在靶基因LIN28A mRNA和蛋白表达情况，并利用免疫组织化学法检测小鼠Ad-miR-370瘤内注射标本中LIN28A表达，评价miR-370对肝癌细胞LIN28A表达影响。2.根据软件预测的miR-370与LIN28A3′端非翻译区（3′untranslation region，3′UTR）的结合位点构建荧光素酶报告基因质粒，检测miR-370对该报告基因作用。用重叠延伸PCR法将LIN28A3′UTR上的结合位点突变后，检测miR-370对突变的报告基因的作用，以验证LIN28A是否为miR-370的直接靶基因。3.利用针对LIN28A的小干扰RNA下调肝癌细胞株中LIN28A表达，利用不包含LIN28A3′UTR的慢病毒表达载体上调LIN28A表达，观察肝癌细胞株迁移和侵袭能力变化。在肝癌细胞株中用上述慢病毒载体上调LIN28A表达，同时在该细胞中过表达miR-370，观察细胞迁移和侵袭能力变化，评价LIN28A是否阻断miR-370对肝癌细胞恶性表型的抑制作用。（二）LIN28A对miR-370成熟体合成的作用1.利用针对LIN28A的小干扰RNA下调肝癌细胞株中LIN28A表达，Real-timePCR法检测miR-370、let-7（阳性对照）、miR-21（阴性对照）成熟体表达变化；构建Flag标记的LIN28A表达质粒（Flag-LIN28A），并用重叠延伸PCR法使与LIN28A结合RNA能力相关的单个氨基酸位点（C161A）突变，Real-time PCR法检测肝癌细胞株转染对照质粒、Flag-LIN28A质粒、C161A突变质粒后miR-370、let-7和miR-21成熟体表达变化。2.利用RNA结合蛋白免疫共沉淀实验及Real-time PCR法检测与肝癌细胞株PLC/PRF/5细胞中内源性LIN28A结合的RNA中miR-370前体的表达。3.肝癌细胞株MHCC-97H转染对照质粒、Flag-LIN28A质粒、C161A突变质粒48小时后，利用RNA结合蛋白免疫共沉淀实验及Real-time PCR法检测与LIN28A结合的RNA中miR-370前体的表达，观察LIN28A是否特异性结合miR-370前体。三、miR-370-LIN28A-NF-κB环路对肝癌细胞的作用（一）LIN28A对NF-κB通路的作用1.利用针对LIN28A的小干扰RNA下调肝癌细胞株中LIN28A表达，利用LIN28A慢病毒表达载体上调LIN28A表达，报告基因实验检测肝癌细胞株中NF-κB通路荧光素酶报告基因的活性变化，Real-time PCR法检测RelA/p65及NF-κB下游靶基因IL6、TNFα和MMP9表达变化，Western Blot法检测RelA/p65蛋白表达情况，观察LIN28A对NF-κB通路作用。2.利用RNA结合蛋白免疫共沉淀实验及Real-time PCR法检测与肝癌细胞株PLC/PRF/5细胞中内源性LIN28A结合的RNA中RelA/p65的表达。3.肝癌细胞株MHCC-97H转染对照质粒、Flag-LIN28A质粒、C161A突变质粒48小时后，利用RNA结合蛋白免疫共沉淀实验及Real-time PCR法检测与细胞中LIN28A结合的RNA中RelA/p65的表达，观察LIN28A是否结合RelA/p65mRNA。4.构建表达RelA/p653′UTR的荧光素酶报告基因质粒，检测上调或下调LIN28A后RelA/p653′UTR荧光素酶报告基因的活性变化，进一步明确LIN28A是否结合RelA/p653′UTR。5.利用LIN28A慢病毒表达载体上调肝癌细胞株中LIN28A表达后用NF-κB信号通路抑制剂Oridonin和JSH-23处理细胞，观察细胞迁移和侵袭能力变化，评估NF-κB信号通路抑制剂可否阻断LIN28A对肝癌细胞转移能力的促进作用。（二）miR-370-LIN28A-NF-κB调控环路对肝癌细胞恶性表型的作用1.利用miR-370mimic上调肝癌细胞株miR-370的表达，或利用miR-370inhibitor抑制肝癌细胞株miR-370的作用，Western Blot法检测RelA/p65蛋白表达情况；报告基因实验检测NF-κB通路荧光素酶报告基因的活性变化，Real-time PCR法检测RelA/p65及NF-κB下游靶基因IL6、TNFα和MMP9表达变化；免疫组织化学法检测小鼠Ad-miR-370瘤内注射标本中RelA/p65表达，Real-time PCR法检测其中IL6、TNFα和MMP9mRNA表达，根据以上结果综合评估miR-370对NF-κB通路作用。2.肝癌细胞感染不包含3′UTR的LIN28A慢病毒表达载体后转染miR-370mimic，Western Blot法检测RelA/p65蛋白表达情况；报告基因实验检测NF-κB通路荧光素酶报告基因的活性变化，Real-time PCR法检测RelA/p65及NF-κB下游靶基因IL6、TNFα和MMP9表达变化，观察LIN28A是否可阻断miR-370对NF-κB通路的作用。3.肝癌细胞株转染miR-370inhibitor后用NF-кB信号通路抑制剂Oridonin和JSH-23处理细胞，观察细胞迁移和侵袭能力变化，评估NF-кB信号通路抑制剂可否阻断miR-370inhibitor对肝癌细胞恶性生物学行为的促进作用。4.用人重组白介素6处理肝癌细胞株，Real-time PCR法检测miR-370成熟体表达变化，Western Blot法检测LIN28A蛋白表达变化。用甲基化抑制剂5′-氮杂胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine，5-aza-CdR）处理多种肝肿瘤细胞后检测miR-370前前体表达变化，明确miR-370表达受抑是否与甲基化机制相关。5.检测86对人肝癌组织及相应的癌旁组织中miR-370与LIN28A和IL6mRNA表达，分析三者之间表达的关联性。四、统计学处理数据采用SPSS统计软件包（version18.0）进行分析。方差齐性的两组间比较采用双尾的Student’s t检验，结果以以X SD表示；方差非齐性的两组间比较则采用非参数秩和检验Mann-Whitney U检验。P <0.05为具有显著性统计学差异。【实验结果】一、miR-370在体内外抑制肝癌细胞的恶性生物学表型1. miR-370促进肝癌细胞株的凋亡上调miR-370表达可促进肝癌细胞株MHCC-97H、PLC/PRF/5和YY-8103的凋亡，而抑制miR-370活性后可减少由无血清饥饿诱发的肝癌细胞株MHCC-97H和PLC/PRF/5的凋亡。2. miR-370抑制肝癌细胞株的迁移和侵袭能力Transwell小室实验显示miR-370mimic可抑制高转移性的肝癌细胞株MHCC-LM3（与MHCC-97H同源）和YY-8103的迁移和侵袭能力，而miR-370inhibitor可促进这两种细胞的迁移和侵袭能力。3.转染miR-370inhibitor可激活永生化人正常肝细胞株的迁移和侵袭能力。4. miR-370抑制肝癌细胞株皮下成瘤能力将感染腺病毒Ad-miR-370和对照病毒Ad-GFP的MHCC-97H细胞和YY-8103细胞种植于裸鼠皮下，每组8只。在MHCC-97H细胞模型中，Ad-GFP组在种植14天后有3只可触及肿瘤（37.5%），33天后所有小鼠均可触及肿瘤；而Ad-miR-370组在33天后均未见肿瘤生长，38天处死小鼠时仅有4只可触及极小肿瘤（50%）。Real-time PCR结果显示Ad-miR-370组肿瘤组织中miR-370表达显著高于对照组（P <0.05）。在YY-8103细胞模型中，虽然两组均可见肿瘤生长，但处死小鼠时Ad-miR-370组肿瘤的体积和重量均显著低于对照组。5. miR-370抑制肝癌细胞株体内转移能力NOD/SCID小鼠尾静脉注射感染腺病毒Ad-miR-370和对照病毒Ad-GFP并经荧光素酶标记的MHCC-LM3细胞8周后，Ad-GFP组5只小鼠的肺部均可见荧光信号，而Ad-miR-370组5只小鼠中仅有2只小鼠肺部可见较低的荧光信号，Ad-miR-370组肺表面结节数亦显著少于对照组，HE染色证实肺部结节为转移性肝癌。6. miR-370抑制小鼠皮下种植瘤模型生长将MHCC-97H细胞种植于裸鼠双侧皮下，待肿瘤可见时，在同一只裸鼠双侧皮下肿瘤内分别注射Ad-miR-370和Ad-GFP，结果显示Ad-miR-370可显著抑制皮下肿瘤的生长速度和大小。HE染色显示肿瘤呈典型肝癌小梁样改变，且Ad-miR-370注射组肿瘤组织中Ki67阳性细胞减少，TUNEL阳性细胞增多，miR-370表达增高。二、miR-370与靶基因LIN28A可形成双向负反馈环路并在肝癌中发挥作用（一）LIN28A为miR-370直接靶基因并部分介导miR-370对肝癌的抑制作用1. Target Scan和Pic Tar软件预测结果均显示LIN28A3′UTR上含有miR-370的结合位点，且该位点在不同物种间高度保守。Real-time PCR和Western Blot结果显示上调肝癌细胞株miR-370表达后LIN28A mRNA和蛋白表达显著下调，而转染miR-370inhibitor后肝癌细胞中LIN28A mRNA和蛋白表达显著上调。免疫组织化学结果显示小鼠Ad-miR-370瘤内注射标本中LIN28A表达明显减少。2.上调miR-370表达可显著抑制LIN28A3′UTR荧光素酶报告基因活性（P＜0.0001），LIN28A3′UTR上的结合位点缺失突变或点突变后，miR-370对突变报告基因的活性无显著影响，表明LIN28A为miR-370的直接靶基因。3.下调肝癌细胞株中LIN28A表达可显著抑制肝癌细胞株迁移和侵袭能力，与miR-370mimic效应相似；而利用不包含3′UTR的LIN28A慢病毒表达载体上调LIN28A表达后肝癌细胞株迁移和侵袭能力显著增强，与miR-370inhibitor作用类似。而且该慢病毒表达载体可阻断miR-370对肝癌细胞迁移和侵袭能力的抑制作用，表明LIN28A部分介导miR-370对肝癌细胞恶性生物学行为的抑制作用。（二）LIN28A通过结合miR-370前体阻遏miR-370成熟1.肝癌细胞株转染LIN28A的小干扰RNA后LIN28A表达下调，Real-time PCR结果显示miR-370成熟体和let-7成熟体表达显著上调，miR-21成熟体表达无显著变化；肝癌细胞株转染Flag-LIN28A质粒后，与空载对照质粒相比，miR-370和let-7成熟体表达显著下调，miR-21成熟体表达无显著变化；而转染C161A突变质粒后miR-370和let-7成熟体表达无显著变化。2. RNA结合蛋白免疫共沉淀实验及Real-time PCR结果显示与肝癌细胞株PLC/PRF/5细胞中内源性LIN28A结合的RNA中miR-370前体和let-7前体的表达显著上调，miR-21前体表达无显著变化，表明内源性LIN28A可结合miR-370前体。3.肝癌细胞株MHCC-97H转染对照质粒、Flag-LIN28A质粒、C161A突变质粒48小时后，RNA结合蛋白免疫共沉淀实验及Real-time PCR结果显示Flag-LIN28A转染组miR-370前体和let-7前体表达显著上调，miR-21前体表达无显著变化；C161A突变组miR-370前体和let-7前体表达未见显著变化，表明LIN28A可特异性结合miR-370前体。三、miR-370-LIN28A-NF-κB可形成调控环路并在肝癌进展中发挥重要作用（一）LIN28A通过促进RelA/p65翻译激活NF-κB通路1.下调肝癌细胞株中LIN28A表达后肝癌细胞株中NF-κB通路荧光素酶报告基因的活性显著下调，Real-time PCR结果显示NF-κB通路下游靶基因IL6、TNFα、MMP9mRNA表达显著下调，而RelA/p65mRNA表达未见显著改变，但Western Blot结果显示RelA/p65蛋白表达显著下调；反之，上调LIN28A表达后NF-κB通路荧光素酶报告基因的活性显著上调，Real-time PCR结果显示NF-κB通路下游靶基因IL6、TNFα、MMP9表达显著上调，RelA/p65mRNA表达仍未见显著改变，而Western Blot结果显示RelA/p65蛋白表达显著上调，表明LIN28A可能通过转录后调控机制促进RelA/p65蛋白表达，并激活NF-κB通路。2. RNA结合蛋白免疫共沉淀实验及Real-time PCR结果显示与肝癌细胞株PLC/PRF/5细胞中内源性LIN28A结合的RNA中RelA/p65的表达显著上调，表明内源性LIN28A可结合RelA/p65mRNA。3.肝癌细胞株MHCC-97H转染对照质粒、Flag-LIN28A质粒、C161A突变质粒48小时后，RNA结合蛋白免疫共沉淀实验及Real-time PCR结果显示Flag-LIN28A转染组RelA/p65的表达显著上调；C161A突变组RelA/p65的表达未见显著变化，表明LIN28A可特异性结合RelA/p65mRNA。4.下调肝癌细胞株中LIN28A表达可显著抑制RelA/p653′UTR荧光素酶报告基因的活性，而上调LIN28A表达RelA/p653′UTR荧光素酶报告基因的活性显著上调，进一步表明LIN28A直接结合RelA/p653′UTR，从而促进RelA/p65翻译。5. NF-кB信号通路抑制剂Oridonin和JSH-23可部分阻断LIN28A对肝癌细胞的迁移和侵袭能力的促进作用，表明LIN28A部分通过NF-кB信号通路发挥对肝癌细胞恶性表型的调控作用。（二）miR-370-LIN28A-NF-κB调控环路在肝癌进展中发挥重要作用1.上调肝癌细胞株miR-370表达后，RelA/p65蛋白表达下调，NF-κB通路荧光素酶报告基因活性减弱，NF-κB下游靶基因IL6、TNFα、MMP9mRNA表达显著下调；肝癌细胞株转染miR-370inhibitor后RelA/p65蛋白表达显著增加，NF-κB通路荧光素酶报告基因的活性增强，NF-κB下游靶基因表达显著上调。免疫组织化学结果显示小鼠Ad-miR-370瘤内注射标本中RelA/p65表达明显减少，Real-time PCR结果显示其中IL6、TNFα和MMP9mRNA表达显著下降，表明miR-370抑制NF-κB通路。2.上调或下调miR-370表达后RelA/p65mRNA表达未见显著变化，且不包含3′UTR的LIN28A慢病毒表达载体可阻断miR-370对RelA/p65蛋白、NF-κB通路荧光素酶报告基因活性和NF-κB下游靶基因表达的作用，表明miR-370通过靶向作用于LIN28A而抑制NF-κB通路。3. NF-кB信号通路抑制剂Oridonin和JSH-23可部分阻断miR-370inhibitor对肝癌细胞的迁移和侵袭能力的促进作用，表明miR-370部分通过NF-кB信号通路发挥对肝癌细胞恶性表型的抑制作用。4.用人重组白介素6处理肝癌细胞株后miR-370成熟体表达显著下调，LIN28A蛋白表达显著上调。甲基化抑制剂5′-氮杂胞苷处理多种肝肿瘤细胞株后miR-370前前体表达均出现明显上调，表明白介素6抑制miR-370表达的机制可能与甲基化有关。5.检测86对人肝癌组织及相应的癌旁组织中miR-370与LIN28A和IL6mRNA表达并分析这三个分子两两之间表达的关联性，结果显示miR-370水平与LIN28A和IL6mRNA水平均呈负相关，而LIN28A和IL6mRNA水平呈正相关。【结论】1. miR-370可在体内外抑制肝癌细胞的恶性生物学行为；2. miR-370通过其直接靶基因LIN28A发挥抑制肝癌的作用；3. miR-370与LIN28A可形成双向负反馈调控环；4. LIN28A通过转录后调控RelA/p65表达激活NF-κB通路；5. miR-370-LIN28A-NF-κB调控环路参与肝癌的进展。